由TMV54103蛋白基因构建的转基因番茄及其对TMV的抗性

通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将烟草花叶病毒(TMV)的54103蛋白cDNA转入番茄植物中,得到了转基因植株.这些植株抗卡那霉素,具有胭脂碱合成酶的活性.DNA的PCR扩增及Northernblot分析表明,54103蛋白基因已整合到番茄基因组上.攻毒实验表明,未转基因的对照组接种病毒2周后即出现花叶,并且随着时间的推移,花叶症状更加典型.而转基因的植物接种病毒后一直到开花结果都未见发病,即没有花叶出现.     

由TMV54＊10^3蛋白基因构建的转基因番茄及其对TMV的 …

通过土壤农杆菌的介导，将烟草花叶病毒的５４＊１０＾３蛋白ｃＤＮＡ转入番茄植物中，得到了转基因植株，这些植株抗卡那霉素，具有胭脂碱合成酶的活性。     

番茄真核翻译起始因子4E基因RNA干涉及其抗病毒特性研究

植物真核翻译起始因子4E（eIF4E）在蛋白质翻译过程中发挥重要作用．最近研究表明eIF4E在参与植物病毒互作,影响病毒在寄主中复制和侵染过程．文中通过RNA干涉调控番茄eIF4E表达,鉴定eIF4E在植物病毒互作中的作用．根据数据库假设性一致序列（TC171564,TC170275）分别克隆了番茄“中蔬五号”SleIF4E基因及其异构体基因SleIF（iso）4E．构建了SleIF4ERNAi抑制表达载体pSL4D,通过农杆菌介导的方法导入番茄品种“中蔬五号”基因组．PCR检测和Southern blot结果表明,目标基因已整合到番茄基因组中．通过半定量RT-PCR对转基因番茄进行eIF4E表达分析,表明pSL4D转化番茄中eIF4E得到不同程度抑制．转基因植株分别接种PVY和CMV两种病毒,病毒ELISA测定和病毒RNA积累量分析表明,pSL4D转化植株相对于对照组均获得不同程度的病毒抗性,番茄eIF4E参与PVY的复制或侵染寄主过程．就不同病毒而言,RNAi对PVY抗性的调控效果比CMV调控效果好,抑制PIF4E表达可提高植物对PVY的抗性．     

跨界原生质体融合产物细胞遗传物质整合过程中DNA含量变化

报导光合细菌球形红假单胞菌与酿酒酵母跨界原生质体融合的最初产物细胞Ｆ０和Ｆ０ａ在连续９６小时的培养过程中细胞ＤＮＡ含量的变化规律．酵母及光合细菌ＤＮＡ含量分别为（４．２１±０．０４）×１０－８μｇ／ｃｅｌ和（２．４４±０．１２）×１０－８μｇ／ｃｅｌ．Ｆ０培养２４小时ＤＮＡ含量为（１０．５±０．５９）×１０－８μｇ／ｃｅｌ，到培养９６小时为（５．３０±０．４０）×１０－８μｇ／ｃｅｌ，高于任一亲株；而Ｆ０ａ则从（１７．１±０．５９）×１０－８μｇ／ｃｅｌ降低至（９．２７±０．３７）×１０－８μｇ／ｃｅｌ，高于双亲ＤＮＡ含量之和．经统计学ｔ检验，融合产物ＤＮＡ含量与双亲ＤＮＡ含量均存在显著差异ｔ＞ｔ０．０１（１０）．本研究表明原生质体融合初期，遗传物质ＤＮＡ在整合过程中数量逐步降低后可达稳定水平，而其含量高于任一亲株细胞的基本规律．     

利用叶圆片法获得CMV_（CP）转基因烟草植株

利用叶圆片法得到ＣＭＶＣＰ转基因烟草植株ＤＮＡ，ＲＮＡ与ＣＭＶＣＰ放射性标记探针点杂交及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交的结果表明：ＣＭＶＣＰ基固可整合到烟草转基固株并且表达．叶面病毒接种后，转基因植株对ＣＭＶ病毒具有高抗性．     

过表达番茄叶绿体小分子热激蛋白提高植株的耐热性

小分子热激蛋白是植物受到热胁迫后的主要表达产物之一,与植物细胞耐热有密切关系．我们将由CaMV35S启动子驱动的叶绿体小分子热激蛋白cDNA导入番茄,Northern及Western印迹分析表明,叶绿体小分子热激蛋白在转基因番茄中呈现组成型表达,通过测定转基因番茄和未转基因番茄的耐热性,发现转基因株系基础耐热性强于对照,说明叶绿体小分子热激蛋白的过量表达提高了植株的基础耐热性．     

用复制酶基因cDNA探针检测表达病毒外壳蛋白基因马铃薯中的PLRV

利用马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）复制酶基因３′端长约６００ｂｐ的ｃＤＮＡ，用缺口平移方法进行３２Ｐ同位素标记，制备成ｃＤＮＡ探针，通过核酸斑点杂交，对提纯的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）、病毒ＲＮＡ、ＰＬＲＶ感染的马铃薯汁液，表达ＰＬＲＶＣＰ基因的马铃薯叶片及块茎芽进行了检测．结果表明，３２Ｐ标记的复制酶基因ｃＤＮＡ探针特异性强、灵敏度高．可测得提纯病毒的最低含量为４０８ｎｇ／ｍｌ，病毒ＲＮＡ最低量为２７．８ｐｇ／ｍｌ，未转ＣＰ基因接种ＰＬＲＶ的马铃薯叶片提取液的最高稀释度为１３７５．接种ＰＬＲＶ的转ＣＰ基因的抗性马铃薯块茎芽和叶片提取液的最高稀释度为０～１／１５．此探针和只转入病毒外壳蛋白基因，不接种ＰＬＲＶ的转基因马铃薯汁液不发生反应．表明，探针只与ＰＬＲＶ基因组ＲＮＡ特异反应，而不与外壳蛋白基因及其ｍＲＮＡ反应，从而为表达ＣＰ基因的转基因马铃薯中ＰＬＲＶ的检测和抗病性鉴定建立了一种可靠的灵敏的分子生物学技术．此项技术已用于转ＣＰ基因马铃薯Ｄｅｓｉｒｅ，Ｆａｖｏｒｉｔａ，乌盟６０１和虎头的抗病性鉴定     

抗双病毒无标记转基因马铃薯的获得

病毒侵染导致品种退化是马铃薯生产中的一大难题．利用RNA沉默技术和无标记转基因技术,把马铃薯X病毒的外壳蛋白基因（cp）片段和马铃薯Y病毒的复制酶基因（NIb）片段的融合基因构建成反向重复序列,农杆菌介导转入马铃薯品种紫花白,经PCR检测初筛的转基因植株定植．对定植当代和薯块繁殖的无性一代植株接种马铃薯X病毒和Y病毒,利用半定量RT—PCR和DAS—ELISA检测,鉴定出了对马铃薯X病毒与Y病毒双抗的无标记转基因株系．siRNA的Northernblot结果表明,所转基因的mRNA已经降解成小片段,转基因植株的双抗性是RNA沉默的结果．由于转基因的mRNA已降解,转基因植株不存在标记基因,同时规避了目的基因和标记基因的潜在生物风险．     

脱落酸受体及其基因的分子免疫学研究(英文)

发展了研究脱落酸（ＡＢＡ）结合蛋白的两类免疫探针。其一,用ＡＢＡ－Ｃ１－ＢＳＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析柱纯化出ＡＢＡ结合蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示该蛋白分子量为５６ＫＤ的一条带,它具有特异结合ＡＢＡ的能力（Ｋｄ＝２．０×１０－９ｍｏｌ／Ｌ）。当用蛋白水解酶Ｋ水解该蛋白,并用１％琼脂糖凝胶电泳时,发现其中存在约３００个核苷酸的ｒＲＮＡ分子。用识别ＡＢＡ结合蛋白的抗体筛选ｃＤＮＡ表达文库,从２００,０００个独立噬斑中获得１２０个编码玉米１７ｓＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆和１个ｃＤＮＡ编码结合蛋白的ｃＤＮＡ克隆（２４ｃＤＮＡ）。２４ｃＤＮＡ有１０７５个碱基对,含编码２５４个氨基酸的开放阅读框架。其二,制备了识别抗ＡＢＡ单克隆抗体的独特型抗体（ａｎｔｉ－Ｉｄ）,它具有模拟并竞争ＡＢＡ的能力。用上述两类免疫探针定位了植物细胞中的ＡＢＡ结合蛋白。发展了研究脱落酸（ＡＢＡ）结合蛋白的两类免疫探针。其一,用ＡＢＡ－Ｃ１－ＢＳＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析柱纯化出ＡＢＡ结合蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示该蛋白分子量为５６ＫＤ的一条带,它具有特异结合ＡＢＡ的能力（Ｋｄ＝２．０×１０－９ｍｏｌ／Ｌ）。当用蛋白水解酶Ｋ水解该蛋?     

血友病B基因治疗临床试验的安全性研究

报道了血友病Ｂ基因治疗临床Ｉ期试验的安全性研究，包括反转录病毒基因的ＤＮＡ聚合酶反应（ＰＣＲ）、反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）、Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交以及ｎｅｏ基因和ｌａｃＺ基因的补求分析（ｒｅｓｏｕｅａｓｓａｙ）．从ＤＮＡ水平，ＲＮＡ水平和病毒活性体水平对野生型病毒进行了检测，没有检测到反转录病毒，并对兔和人转基因细胞进行形态学观察，染色体核型分析，软琼脂实验，裸鼠接种实验，兔和裸鼠的病理检测及电镜分     

长江三峡水库兴建后库周地区辐射平衡与地面径流变化之探讨

从地球表面水量平衡、热量平衡两个基本方程出发，通过对其中一系列变量在三峡建库前后变化的分析，推导库周地区辐射平衡、蒸发量、年径流量等重要水热因素将会发生的变化，从而对整个库区环境的演变可窥豹一斑．库周沿江地区辐射平衡将增大约４２％～６７％，即（８０～１２６）×１０３Ｊ·ｃｍ－２·ａ－１，库周地表蒸发量平均将增大约２％～４％，其中重庆地区增加幅度大于宜昌地区，库周地表径流将减少约８％～１０％，即４５～５５ｍｍ·ａ－１，库区潜热通量将增加２％～４％左右，即（２９～５４）×１０３Ｊ·ｃｍ－２·ａ－１，库周地区地面与大气间的湍流显热交换将增加约１０％～１５％，即（４２～８·４）×１０３Ｊ·ｃｍ－２·ａ－１．     

不同品种梨多酚氧化酶特性及其抑制剂的研究

对不同品种梨多酚氧化酶（ＰＰＯ）粗提液，以邻苯二酚为底物，测定了不同ｐＨ值、温度及抑制剂对其活性的影响。结果表明：雪花梨、安梨、白梨、鸭梨ＰＰＯ的最适ｐＨ值分别为６．４，６．２，６．０，６．６；最适温度分别为２４，２２，２０，３０℃；在最适ｐＨ值和温度条件下果肉中所含ＰＰＯ的活性分别为３．２１２×１０３，４．７５２×１０３，３．３４４×１０３，３．８７２×１０３ｕ·ｇ－１ＦＷ。雪花梨和安梨ＰＰＯ对偏二亚硫酸钠反应最敏感，白梨ＰＰＯ对ＧＳＨ（谷胱甘肽）反应最敏感，鸭梨ＰＰＯ对Ｖｃ（维生素Ｃ）反应最敏感。     

番茄SlWRKY80基因共抑制表达影响转基因植株抗逆性的研究

利用植物基因工程技术,构建了植物表达载体pBI121-35S::SlWRKY80,并利用根癌农杆菌介导法转化番茄,得到转基因阳性植株.通过生物信息学分析SlWRKY80蛋白序列与9种物种进行同源比对,发现高度保守的WRKY结构域和C2HC型锌指结构.采用Real-Time PCR分析转基因植株中SlWRKY80mRNA的表达情况,结果显示SlWRKY80的表达量显著下调,出现共抑制现象.用不同浓度的NaCl对转基因种子和野生型种子进行胁迫处理,结果显示在NaCl浓度为100mM和150mM时,转基因幼苗初生根的长度与野生型相比相对较短,显示SlWRKY80对初生根的生长有促进作用;用Pto DC3000接种转基因植株和野生型植株叶片,结果显示野生型植株叶片中细菌增殖率是转基因植株叶片中的2.5倍,显示SlWRKY80在番茄抗病信号转导中扮演负调控作用.     

复制酶基因介导的抗病毒烟草植株的研究

将构建的携带烟草花叶病毒（ＴＭＶ）５４ＫＤ蛋白基因及黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）３’端缺失０．９Ｋｂ的１．６Ｋｂ片断复制酶基因植物表达载体ｐＢＩＣＴ，导入根癌农杆菌３１１ＳＥ系，用叶圆盘法转化烟草，在含有卡那霉素的选择性培养基上诱导生芽、生根，得到２８株成活苗．移入大田后，随机挑选４．株植物，提取植物总ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增、Ｓｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测，结果４株植物中都有复制酶基因的整合，而未经转化的对照组植物则没有．转基因植株在大田试验中表现了良好的抗烟草花叶病毒及黄瓜花叶病毒能力．     

金鱼草Del基因影响烟草花色素苷的研究

采用根癌农杆菌介导法,获得转Ｄｅｌ基因的转基因烟草植株．对９株可能的转基因植株（Ｔ０代）ＤＮＡ进行ＮＰＴⅡ基因的ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交分析,其中８株显示ＮＰＴⅡ基因阳性．对其中５株开花的阳性植株进行ＤｅｌＤＮＡ的ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交分析,全部显示ＤｅｌＤＮＡ阳性．Ｋｍ抗性Ｔ１代转基因植株ＤＮＡ进行ＤｅｌＤＮＡ的ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交分析,结果显示全部含有ＤｅｌＤＮＡ．在５３０ｎｍ处测量Ｔ０代转基因植株中花色素苷含量和分布情况,３株转基因烟草的花萼、花冠和雄蕊部位花色素苷含量增加,而在雌蕊和叶中减少．在一定程度上验证了Ｄｅｌ基因的生物学功能,证实并补充了Ｇｏｏｄｒｉｃｈ等关于色素沉积模式的论述．     

杀虫晶体蛋白基因CryIA（c）表达载体构建与表达研究

为了检测改造后的ＣｒｙＩＡ（Ｃ）基因在植物中的表达，将其构建成表达载体并采用膛杆力介导的方法导入蕃茄，通过对转基因番茄植株的ＰＣＲ，Ｓｏｕｔｈｅｍ和Ｎｏｒｔｈｅｍ ｂｌｏｔ分析，证实外源ＣｒｙＩＡ（ｃ）基可整合到番茄基因组中，并能顺利表达，为该基因在其它农作物上的提供了依据。     

植酸酶基因表达与调控机制研究(Ⅱ)──番茄幼苗cDNA文库构建与植酸酶基因筛选

采用异硫氰酸胍法从发芽３～４ｄ的番茄幼苗中提取出总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离纯化ｍＲＮＡ．以ｍＲＮＡ为模板,Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物用逆转录法合成双链ｃＤＮＡ．将ｃＤＮＡ与ＥｃｏＲＩ接头连接后克隆到表达载体λｇｔ１１的单一ＥｃｏＲＩ位点,经体外包装后感染宿主菌Ｙ１０９０,成功地构建了完整的番茄幼苗ｃＤＮＡ文库．用颜色筛选法筛选重组子,然后用植酸酶抗体做探针进行免疫筛选,得到两个阳性克隆．挑取阳性克隆噬菌斑扩增后纯化ＤＮＡ,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,显示确有外源ＤＮＡ存在．该插入片断序列测定正在进行．     

非离子型微乳液对铜─二甲酚橙分光光度分析的增敏作用

以含水量为９４．１％的非离子型乳化剂ＯＰ／ｎ－Ｃ５Ｈ１１ＯＨ／ｎ－Ｃ９Ｈ２０／Ｈ２Ｏ微乳液为介质，进行了Ｃｕ（１１）－二甲酚橙ＯＸ分光光度法研究（ε＝３．６×１０４Ｌ·ｍｏｌ－１·ｃｍ－１），与以水为介质（ε＝５．２×１０３Ｌ·ｍｏｌ－１·ｃｍ－１）及相同含水量的乳化剂ＯＰ胶束介质（ε＝１．１４×１０４Ｌ·ｍｏｌ－１·ｃｍ－１）相比较，测定灵敏度显著增加，样品分析结果令人满意。     

SCF和IL—3对脐血造血细胞长期液体培养的影响

考察了干细胞因子（ＳＣＦ）和白介素３（ＩＬ－３）的不同浓度（５～１００ｍｇ／Ｌ）组合对不同接种密度（分别为３×１０５、６×１０５、１０×１０５ｃｅｌｓ／ｍＬ）的脐血（ＣＢ）细胞扩增和分化的影响。在５种组合下,ＣＦＵ－ＧＭ的扩增倍数都是在ＣＢ单个核细胞培养１２ｄ后达到最高（（１６．４３±２．０８）～（３７．０２±４．６９）,平均为（２５．７５±３．２６））,各组合之间相差较小;而细胞总数的扩增倍数在培养２４ｄ后达到最高（（１４．３８±２．７２）～（３５５．２６±３５．５３）倍,平均为（１０３．４５±３８．７５））,各组合之间相差很大。结果表明,在静态细胞培养过程中细胞密度较高,不利于ＣＦＵ－ＧＭ和总细胞的扩增,如保持在较低细胞密度有利于总细胞数的扩增;细胞因子的浓度对ＣＦＵ－ＧＭ的峰值影响不大,但低浓度能使总细胞数的扩增明显减少。     

兰属4种植物DNA指纹图的初步研究

采用ＪＨ－１８·８寡核苷酸探针检测了兰属４植物基因组ＤＮＡ中的酶切片段，获得了由１０－１１条分子杂交谱带组成的ＤＮＡ指纹图谱，结果表明：在４．０－２４．０Ｋｂ范围内，大红朱砂（Ａ）的谱带数为１０条，红蝉（ＢＢ）为１０条，Ａ×Ｂ→Ｆ１２Ｎ＝４０（Ｃ）为１１条，Ａ×Ｂ→Ｆ１２Ｎ＝８０（Ｄ）为１１条，ＪＨ－１２·８探针能与兰属植物基因组ＤＮＡ小的简单重复序列形成杂交分子，表明兰属４植物基因组中存在同源的ＤＮＡ片段，为进一步在分子水平上进行兰扈植物的遗传多样性和近缘种群间的遗传差异分析提供了一种简便方法。