Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/ pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.     

抗生素生物合成基因簇克隆方法

抗生素生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提,PCR技术、基因文库的构建及标记探针的筛选、异源宿主的表达和染色体步查等方法, 常用于抗生素生物合成基因簇的克隆.载体系统及生物信息学的发展对基因克隆产生了重大影响.     

抗生素生物合成基因簇克隆方法

抗生素生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提,PCR技术、基因文库的构建及标记探针的筛选、异源宿主的表达和染色体步查等方法,常用于抗生素生物合成基因簇的克隆。载体系统及生物信息学的发展对基因克隆产生了重大影响。     

日本血吸虫体壁抗原基因的筛选与克隆

为筛选并克隆新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)候选抗原基因,以日本血吸虫成虫总DNA为模板,通过生物信息学以及分子生物学手段从日本血吸虫全基因组中筛选目的基因.根据所筛选到的目的基因的核酸序列设计合成引物,用PCR法扩增目的基因,将其克隆入pBS-T载体后转入到大肠杆菌DH5a菌株,筛选阳性克隆.通过对阳性菌落质粒进行PcR予以证实.最终成功筛选并克隆到日本血吸虫体壁候选抗原基因.     

阿维链霉菌中转录因子AveR对阿维菌素生物合成的正调节

aveR是阿维链霉菌NRRL 8165阿维菌素生物合成基因簇中唯一可能的调节基因.为了验证aveR是否参与阿维菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于敲除aveR的基因置换质粒pJTU2530,并通过接合转移引入了阿维链霉菌.通过筛选ThioSAprR转化子,经聚合酶链式反应(PCR)扩增验证,获得了aveR内部1 320 bp区域被阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV替换的突变株ZD10.高压液相色谱检测表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10不再产生阿维菌素,并且ZD10中寡霉素的产量明显高于野生型菌株.进一步的反转录PCR(RT-PCR)分析表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10的聚酮合酶基因aveA3不再转录.结果显示,AveR是阿维菌素生物合成的正调节因子,通过调节结构基因的转录表达来影响阿维菌素的产生.     

对氨基苯甲酸生物合成基因pabAB的缺失对抗生素FR-008生物合成的影响

抗生素FR-008是由链霉菌FR-008产生的一种七烯大环内酯类抗真菌抗生素,它以对氨基苯甲酸(PABA)为起始单位,在I型聚酮合酶(PKS)的催化下合成聚酮内酯环.前期生物合成基因簇序列测定发现了可能的对氨基苯甲酸生物合成基因(pabAB),编码4-氨基-4-脱氧-分支酸(ADC)合成酶.通过同框缺失实验获得pabAB发生缺失的基因置换突变株BLQ-1并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增进行了验证.高效液相色谱(HPLC)分析和生物测定证实突变菌株BLQ-1丧失了合成抗生素FR-008的能力.这种产量的丧失可以通过回补克隆的pabAB基因或喂养外源PABA得到回复.实验证明,pabAB负责对氨基苯甲酸的合成,是抗生素FR-008生物合成的必需基因.     

黑曲霉F246的phyA基因克隆及其新型表达载体构建

利用PCR法直接从自行筛选、鉴定的黑曲霉F246中扩增出phyA基因,再将PCR产物重组于乳酸菌表达载体pMG36e,构建phyA基因的新型表达载体pMG36e-phyA.以黑曲霉F246基因组为模板,对phyA基因的成熟肽(1 347 bp)进行PCR扩增.再将PCR产物克隆入pMD18T质粒,经DNA测序和氨基酸分析、鉴定正确后,亚克隆入乳酸菌表达质粒pMG36e,构建工程菌Lactobacillus MG1363-pMG36e-phyA.重组乳酸菌表达载体pMG36e-phyA的构建,可望获得大量、高活性植酸酶,为研制多功能微生态制剂奠定基础.     

PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进

分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PCR(RT-PCR)获得目的基因片段,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PCR及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。     

厦门霉素生物合成基因簇在白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008中的异源表达

将携带有厦门霉素生物合成的整合质粒p LMO09404,通过供体菌大肠杆菌ET12567(p UZ8002)与受体菌白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008进行接合转移,将得到的接合转移菌株经PCR验证后进行发酵,发酵液经HPLC和质谱检测.结果显示,厦门链霉菌来源厦门霉素基因簇可以在白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008中异源表达.     

新疆绵羊β-乳球蛋白(BLG)5′端调控区的克隆与序列测定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段.通过T4 DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段.经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致.