Identification and characterization of two novel box HACA snoRNAs from Schizosaccharomyces pombe

Through constructing a specialized cDNA library based on small RNAs isolated from partial purified nuclei of Schizosaccharomyces pombe, two novel noncoding RNAs, termed Sp15-70 and Sp18-61, have been identified. Bioinformatics analysis reveals that both the novel RNAs possess a typical secondary structure of box HACA snoRNA and antisense elements to rRNAs. According to the relationship between the structure and function of box HACA snoRNA, Sp15-70 was predicted to direct pseudouridylation in 25S rRNA at U2401 and U2298; Sp18-61 was predicted to direct pseudouridylation in 18S rRNA at U208 and 25S rRNA at U2341. The four predicted pseudouridylation sites were all verified experimentally by the CMC-primer extension analysis. Both Sp15-70 and Sp18-61 were encoded by single copies which were located in the intergenic regions between the CDS of two protein-coding genes on chromosome Ⅰ and Ⅲ of S. pombe, respectively. Putative TATA-like elements can be found upstream from the 5′ end of these snoRNA genes, suggesting that they could be transcribed from their own promoters. Comparison of the two snoRNAs and their functional homologues in diverse organisms reveals that extensive recombinations among different snoRNAs have occurred during the evolution from their primitive progenitors.     

核仁小分子RNA及其基因组织形式

核仁小分子RNA(snoRNA)是非编码RNA中研究得最多,了解得最详细的成员之一。依据snoRNA保守的序列和结构元件可将其分成三类:box C/D snoRNA,box H/ACA snoRNA以及MRP RNA。它们的主要功能分别为指导rRNA或snRNA中特异位点的2′-O-核糖甲基化修饰、假尿嘧啶化修饰或作为分子伴侣参与靶标RNA高级结构的形成。目前发现的snoRNA基因组织主要有四种形式:独立基因编码的snoRNA、内含子编码的snoRNA、多顺反子snoRNA基因簇和内含子编码的snoRNA基因簇。但是,并不是每种生物都具有这四种基因组织形式。大多数脊椎动物的snoRNA产生于蛋白质基因的内含子中,植物snoRNA基因多以基因簇的形式存在,大部分酵母snoRNA由独立基因编码,锥体虫snoRNA以多顺反子形式存在,果蝇snoRNA基因都位于宿主基因的内含子中。随着对snoRNA研究工作的不断深入,snoRNA基因组织形式也呈现出前所未有的复杂性和多样性。     

粟酒裂殖酵母SnoRNA snR90基因缺失株的筛选鉴定

snR90是在粟酒裂殖酵母中发现的一种单基因编码的box H/ACA类snoRNA.在利用遗传手段在粟酒裂殖酵母基因组中敲除了snR90基因后,通过选择性培养基、PCR、Northern杂交这一系列方法筛选鉴定出snR90基因缺失株.该基因缺失株ΔsnR90的成功构建对snR90功能的分析很有的意义.     

粟酒裂殖酵母snR41 snoRNA的鉴定及其结构进化的意义

采用计算机分析和分子生物学实验的方法,在粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中发现和鉴定了一种新的反义snoRNA,命名为snR41,与酿酒酵母Sacharomyces cerevisiae snR41同源分子比较,粟酒裂殖酵母snR41只具有一个指导rRNA核糖甲基化的反义序列,这一发现进一步揭示了反义snoRNA同源分子在一级结构上的多样性,为研究反义SnoRNA结构及进化提供了新的线索。     

两种相邻分布的水稻U14 BoxC/D snoRNA

通过对酵母U14BoxC/DsnoRNA保守元件的分析,推测出水稻BoxC/DsnoRNA可能具有的保守序列,进而在水稻第二号染色体上找到可能编码两种BoxC/DsnoRNA的序列.这两个BoxC/DsnoRNA在染色体上相邻分布,具有典型的BoxC和BoxD序列,末端形成茎环结构,这也是BoxC/DsnoRNA一个显著的特点.它们含有一段相同的“引导”序列,此序列能与水稻18S核糖体RNA(rRNA)第414位到第427位互补配对,这两者可能行使相同的功能:介导此配对区域内rRNA的核糖的甲基化.通过实验证明:(1)水稻18S核糖体RNA的配对区域内的确存在甲基化修饰;(2)这两种BoxC/DsnoRNA存在于水稻细胞中.通过序列同源性比较发现与玉米U14snoRNA有很高的同源性.将这两种在水稻中发现的BoxC/DsnoRNA命名为U14.1snoRNA和U14.2snoRNA.编码这两种BoxC/DsnoRNA的基因已被GenBank收录,其编号为AF332622.     

同源重组法敲除酵母snoRNA基因的初步探讨

以3个粟酒裂殖酵母核仁小RNA为对象,通过同源重组法构建相应的基因缺失株,并对影响同源重组效率的因素进行分析.结果显示:载体骨架的切除可以显著提高同源重组效率;增加两侧同源片段的长度也能提高同源重组效率;另外,利用粟酒裂殖酵母野生型单倍体菌株进行snoRNA 基因敲除是可行的.     

Z3, a novel antisense snoRNA fromSaccharomyces cerevisiae

Small nucleolar RNA (snoRNA) is one of the most important elements participating in eukaryotic ribosomal biogenesis. The present report describes the results of the identification of a novel snoRNA, Z3, from yeast S. cerevisiae. Z3 snoRNA is 106 nts in length. It contains box C, D elements and a 13 nt complementarity to 25S rRNA. This antisense segment, together with the downstream box D, guides a 2′-O-ribose methylation of cytidine acid at position 2956th in yeast 25 S rRNA. Z3 snoRNA, encoded by an independent transcribed gene on the chromosome  of yeast, possesses the same functional elements responsible for the rRNA methylation site as that of the intron-encoded U35 snoRNA of vertebrate.     

Z25，哺乳动物核仁蛋白基因编码的一个新的内含子snoRNA

通过计算机分析和实验鉴定,发现了哺乳动物中一种新的内含子snoRNA． Z25．Z25 snoRNA长为69个核苷酸,具有典型的boxC／D结构元件和末端配对区,一 段长为11个核苷酸的序列与18S rRNA互补,其下游紧接boxD’．按照理论计算,Z25 snoRNA具有指导18S rRNA中A1678(按人18S rRNA编号)2’．0．核糖甲基化的功能． Z25基因位于人、小白鼠和大鼠核仁蛋白(Nucleolin)基因第5个内含子中,揭示出哺 乳动物核仁蛋白基因是一种多内含子snoRNA编码的宿主基因．     

snoRNA及其结构与功能研究新进展

snoRNA(small nucleolar RNA)是细胞核内一类高丰度的小分子非编码RNA.近10年来,采用RNA组学方法,已从多种模式生物中鉴定出大量新的snoRNA.研究结果表明:snoR-NA参与rRNA前体加工与折叠,并具有指导rRNA,tRNA和snRNA转录后核苷修饰功能.近年来发现一类新的孤儿snoRNA(orphan snoRNA),如哺乳动物大脑组织特异性表达的HBII-52,参与mRNA前体可变剪接的调控,并与一种遗传疾病Prader-Willi syndrome的发生密切相关.由此可见,snoRNA是一类兼有组成型和调控型特点的小分子非编码RNA,是"RNA调控"网络的重要组成部分.     

粗糙脉孢菌U3 snoRNA基因的鉴定及其表达和功能分析

通过对粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）小RNA的cDNA文库筛选及基因组分析,鉴定了3个U3snoRNA基因,命名为NcU3A、NcU3B和NcU3C,这3个基因表达的U3snoRNA的大小分别为262,270和275nt．同时,Northern杂交还揭示出不同大小的U3snoRNA剪切变体,表明U3 snoRNA的表达存在复杂的转录后加工．粗糙脉孢菌U3snoRNA都具有物种间保守的与18SrRNA配对的功能区;NcU3A及其剪切变体还具有一段过去没有报道的与26SrRNA互补的反义序列,这段反义序列并不指导对应的rRNA位点的甲基化修饰,可能具有rRNA分子伴侣的作用．粗糙脉孢菌U3 snoRNA都是独立转录的基因,每个基因中均包含一个小内含子序列,其插入位点与酵母U3相似,表明它们古老的起源．研究结果对阐明U3 snoRNA的结构进化及功能多样性具有重要意义．     

粟酒裂殖酵母--一种良好的真核模式生物(Ⅰ)

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)虽然与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同属于子囊真菌,但许多研究表明两种酵母在系统分类、细胞周期、rRNA的生物合成和基因的组织、结构及基因的表达调控等方面并不相同,在某些方面粟酒裂殖酵母与高等动物却有一定的相似性,因此,粟酒裂殖酵母也是一种良好的研究真核生物的模式生物.     

粟酒裂殖酵母麦芽糖酶基因的克隆及在大肠杆菌内的表达

利用PCR的方法，以粟酒裂殖酵母菌的染色体DNA为模板，扩增得到粟酒裂殖酵母的结构基因，其开放阅读框1740 bp的序列，可以编码579氨基酸，分子量为67.7 kD.利用NCBI对它的蛋白序列进行比对，发现这个蛋白序列与Aspergillus oryza、Candida albicans、Hansenula polymorpha、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pastorianus的麦芽糖酶相比分别具有40.6%、41.6%、37.9%、34.7%、34.5%的相似性.而与粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶具有99.8%的相似性，由此可以得出克隆得到的结构基因应该是粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶结构基因.将克隆的粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶基因克隆到pQE30表达载体中在大肠杆菌中进行诱导表达，然后测定其麦芽糖酶的活力，其酶的比活力是野生菌株的21倍，诱导条件下麦芽糖酶的比活力是非诱导条件下的10倍.     

粟酒裂殖酵母--一种良好的真核模式生物(Ⅱ)

粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)虽然与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)同属子囊真菌，但许多研究表明两种酵母在系统分类，细胞周期，rRNA的生物合成和基因的组织、结构及基因的表达调控等方面并不相同，在某些方面粟酒裂殖酵母与高等动物却有一定的相似性，因此，粟酒裂殖酵母也是一种良好的研究真核生物的模式生物。     

基于表达序列标签的萝卜ACA36基因簇鉴定

利用国际公用的表达序列标签（EST）数据库资源,运用生物信息学分析方法,在萝卜（Raphanus sativus）一条表达序列标签中发现一个新的snoRNA基因簇。此基因簇含有一个box H/ACA snoRNA基因和两个box C/D snoRNA基因,分别命名为RsACA36、RssnoR66和RsSNORD88。ACA36可形成典型的box H/ACA snoRNA双茎环二级结构;snoR66和SNORD88都具有典型的C盒与D盒保守元件,末端存在反向互补序列;三个snoRNA都含有能和核糖体RNA互补配对的反向互补序列。RsACA36和RsSNORD88均为在植物中首次发现。基于EST数据库、运用生物信息学方法鉴定snoRNA基因既保留了计算机RNA组学快捷、高效的优点,又使结果因为有了实验支撑而更直接、可信。     

Identification and functional analysis of a novel box C／D snoRNA from Schizosaccharomyces pombe

By constructing and screening the Schizosaccharomyces pombe nuclear cDNA library, a novel small nucleolar RNAs (snoRNA) was identified. The novel snoRNA displays structural features typical of C/D box snoRNA family and possesses a 10-nt-long rRNA antisense element which is predicted to guide the 2‘-O-methylation of the fission yeast 25S rRNA at G940. As expected, the rRNA ribose-methyla- tion site predicted by the novel snoRNA was precisely mapped by a deoxynucleoside triphosphate concentration-dependent primer extension assay. The comparison of functional element of guide snoRNAs among eukaryotes reveals that the novel snoRNA is a partial counterpart of the budding yeast snR60 and was termed snR60-11, snR60-Ⅱ gene nested in the intron of a non-coding RNA gene with an unknown function, which is the first example of a yeast snoRNA encoded in an intron of a non-coding RNA gene. Furthermore, a number of yeast snR60 homologues were also identified from other fungi and fly. Our results reveal that snR60 exhibits diverse genomic organization in eukaryotes, implying the high mobility of snR60 gene in the course of evolution.     

alg3、vps1301、rad51基因缺失对粟酒裂殖酵母接合生殖的影响

为探寻alg3、vps1301、rad51基因缺失对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)生长及接合生殖的影响,在25 ℃条件下,培养野生型和3种基因缺失的粟酒裂殖酵母,统计并分析其生长情况;将野生型和3种基因缺失菌株分别各自交配产孢,分析对比野生型和基因缺失菌株的接合生殖情况. 结果显示,生长实验中,25 ℃条件下,12 h内,野生型菌株、alg3Δ菌株、vps1301Δ菌株和rad51Δ菌株的平均生长速度分别为0.042 5 、0.009 8 、0.019 3 、0.036 9 OD₅₉₅/h. 结果提示,粟酒裂殖酵母缺失alg3基因后,其生长速度受影响最大.在细胞接合生殖实验中,3种基因缺失菌株产孢数目都出现异常,其中alg3Δ菌株产孢数与野生型表现出显著差异.同时,alg3基因和vps1301基因缺失后孢子长度与野生型存在极显著差异.结果表明,alg3基因缺失对粟酒裂殖酵母的接合生殖影响最大.综上所述,缺失上述3种基因都对粟酒裂殖酵母的生长和接合生殖有不同程度的影响,其中alg3基因缺失对其影响最严重,其次是vps1301基因,rad51基因对其影响最小.     

Identification and functional analysis of 23 novel box C／D snoRNAs from Oryza sativa

In a cDNA library generated from rice small nuclear RNAs,30box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) were identiffied through preliminary screen.Except 7 known snoRNAs such as U14,all snoRNAs were identified in rice for the first time experimentally.Among the 23 novel snoRNAs,11 snoRNAs appear rice-specific,6 snoRNAs are unique to plants,the remaining 6 snoRNAs have their counterparts in both Arabidopsis and yeast or mammals according to the conserved antisense sequencs that guide 2‘-O-ribose methylation of rRNA,17 of the 23 novel snoRNAs were predicted to guide 24 2‘‘-O-ribose methylations at the specificsites of rice 5.8S,18S,25S rRNAs,among which 19 methylated sites were determined by primer extension at low dNTP concentrations.The remaining 6 snoRNAs devoid of rRNA antisense elements may represent novel snoRNA species in rice.The results show that constructing a cDNA library from small nuclear RNAs is an effective experimental approach for novel snoRNA is identification.The novel snoRNAs are important in elucidating the genomic organization and expression of plant snoRNA genes and the mechanism through which 2‘‘-O-ribose methylations took place in rRNAs.     

醇酒酵母反义snoRNA一级结构的分析

对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因组中发现和鉴定的41个反义snoRNA进行一级结构的分析表明：酿酒酵母snoRNA基因富含AT：41个反义snoRNA全都有boxC'和boxD'结构元素；根据反义snoRNA保守结构元素及反义序列的数目和位置的特点，将反义snoRNA分为5种结构类型，认为snoRNA具有两个主要的功能区；在snR57、snR59、snR71和snR75不具有指导甲基化反义序列的功能区中，发现有一段长10－12个核苷酸的序列与rRNA互补，为进一步研究反义snoRNA的结构与功能提供了重要线索。     

家蚕新的非编码RNA功能初探

构建了家蚕50～500 nt非编码RNA的cDNA文库,发现了189个新的ncRNA,其中一个小RNA-Bm-86在家蚕幼虫和蛹中的表达量显著高于卵和成虫.利用生物信息学软件对该ncRNA的特性及其与上下游基因的关系进行了深入分析,并利用Northern杂交和半定量RT-PCR技术对该ncRNA与其宿主基因在家蚕不同组织的表达情况进行了研究.结果发现,该ncRNA属于H/ACA box snoRNA家族,是由家蚕eIF5A基因的第二个内含子转录产生的,且在家蚕中没有明显的靶标位点.分析其上下游基因结构发现,在其上游263 bp处存在着一个可能的启动子位点,表明其有独立转录的倾向.进一步分析Bm-86与其宿主基因eIF5A在家蚕不同组织部位的表达情况发现,二者在表达上存在着负相关的关系,且该现象在丝腺中尤其明显.推测Bm-86可能通过影响eIF5A基因的表达参与到家蚕丝腺发育调控过程中.