分子生物学技术及其在环境样品微生物分析中的应用

综述了荧光原位杂交(FISH)、多聚酶链式反应(PCR)、DNA克隆及DNA测序等分子生物学技术,并将这些分子生物学技术应用到淡水水体底泥厌氧氨氧化茵(anammox菌)和好氧氨氧化菌的原位检测中,从底泥样品中鉴别出这两种细菌,其中好氧氨氧化菌属于亚硝酸单胞菌属,厌氧氨氧化菌属于anammox菌的Brocadia分支,为进一步研究淡水环境中氮的微生物循环过程提供了一定的依据．     

丹江口水库上下游古菌优势菌群落结构特征分析

采用16S rRNA Illumina Miseq高通量测序技术, 分析丹江口水库库区及汉江下游古菌物种组成, 并对大坝上、下游水体与沉积物中占优势的氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea, AOA)和产甲烷古菌(Methanogenic archaea)群落结构进行分析。结果表明, 优势种群落结构组成受到水体与沉积物样本差异的影响, 可由氨氧化古菌的好氧特性与产甲烷古菌的厌氧特性合理地解释。网络图分析表明, 丹江口水库上游氨氧化古菌与产甲烷古菌具有显著的相关关系。受丹江口水库运行的影响, 大坝下游水体及沉积物中氨氧化古菌丰度皆比大坝上游少, 而沉积物中产甲烷古菌丰度较高, 二者间相关性不明显。     

夏季珠江口冲淡水对氨氧化古菌的空间演替及分布规律的影响

氮在海洋生物地球化学循环中起着重要的作用，通常能限制海洋生物的生产力.硝化反应是氮循环的核心环节，且氨氧化反应是硝化作用的限速步骤，再加上氨氧化古菌(Ammonia Oxidizing Archaea, AOA)是氨氧化反应的主力军，因此海洋氨氧化古菌成了研究热点.通过对夏季珠江口的不同深度水体进行研究，以氨氧化古菌的功能基因氨单加氧酶(amoA)作为分子标记，运用454高通量测序技术和定量PCR在DNA和cDNA水平上来分析氨氧化古菌的群落结构组成、多样性和基因丰度分布特征.结果表明，夏季珠江口的淡水来源站位(A2B)有着最高的氨氧化古菌群落多样性，但丰度最低；自由生活型的氨氧化古菌丰度是附着生活型的10～1 000倍，这可能是氨氧化古菌的主要生存策略；盐度是影响夏季珠江口氨氧化古菌群落结构组成的主要环境因子，而其amoA基因丰度与环境因子之间没有显著性差异；表层和底层AOA群落之间的差异较自由生活的与附着的群落之间更为明显.研究表明在cDNA水平上对功能微生物类群进行探究的必要性，有助于增进水体氨氧化古菌群落响应环境变迁的认识.     

污水处理系统中氨氧化古菌种群的发现及其生存的影响因素

氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)的发现给研究氨氧化提供了新思路.介绍了氨氧化古菌的发现以及不同环境下氨氧化古菌的活性及其群落变化规律,主要分析了不同环境因子对氨氧化古菌群落结构和丰度的影响.研究表明氨氧化古菌对氨的亲和力比较强,对溶解氧的适应范围也比较大,并且在溶解氧较低和pH偏酸性条件下占主导地位.与此同时,氨氧化古菌对温度的适应性很广,对环境适应性很强.最后对氨氧化古菌今后的研究方向进行了展望.     

沸石载体恢复受饥饿影响厌氧氨氧化菌的性能研究

利用沸石良好的吸氨能力和微生物载体功能, 将受饥饿影响的厌氧氨氧化菌在含沸石的反应器内进行活性恢复, 研究沸石对长期饥饿影响下厌氧氨氧化菌恢复过程中菌群活性及结构的影响。结果表明, 经过82天的运行, 沸石反应器和对照反应器(无沸石添加)内厌氧氨氧化菌均获得恢复。沸石反应器的脱氮效率从第59天开始与对照反应器拉开差距, 运行第82天时, 沸石反应器中氮去除负荷(NRR)为177.8 mgN/(L·d), 显著大于对照反应器 (154.3 mgN/(L·d))。利用16S rRNA高通量测序方法, 对反应器内菌群的微生物组成与功能进行分析, 发现投加沸石载体使得恢复后的厌氧氨氧化菌Candidatus Brocadia的丰度更高, 可以更好地促进受饥饿抑制的厌氧氨氧化菌的恢复。     

不同种泥和运行方式对启动厌氧氨氧化反应器的影响

采用6个相同的序批式反应器(SBR),以好氧硝化-厌氧氨氧化和直接厌氧氨氧化2种运行方式,分别以河岸带污泥、好氧污泥和厌氧污泥为接种污泥启动厌氧氨氧化反应器。研究结果表明,采用好氧硝化-厌氧氨氧化方式时,接种河岸带污泥和好氧污泥的反应器分别在第110天和165天实现了厌氧氨氧化反应;接种河岸带污泥的反应器启动更快,对氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别可达94%和99%,接种好氧污泥的反应器对氨氮和亚硝酸盐氮的去除率最高仅为53%和67%;接种厌氧污泥的反应器并未发生明显的厌氧氨氧化反应。直接以厌氧氨氧化方式运行的反应器,3类种泥都培养了190 d,没有出现厌氧氨氧化现象。     

厌氧氨氧化影响因素分析研究

厌氧氨氧化是目前最简捷、最经济的生物脱氮途径之一,受到极大的关注,但是厌氧氨氧化菌生长缓慢,环境条件要求高,综述了基质浓度、温度、pH值对厌氧氨氧化活性的影响,探讨适合厌氧氨氧化菌生长的有利条件,并对厌氧氨氧化的发展提出了建议。     

冷藏孵育对厌氧氨氧化低温脱氮性能和菌群结构的影响

为提高厌氧氨氧化菌在低温(10～15℃)下的脱氮能力,将厌氧氨氧化菌群在5℃低温孵育,探究复苏的厌氧氨氧化菌的低温氮代谢能力。结果表明,经过92天的低温孵育,厌氧氨氧化菌在12±1℃的环境温度下脱氮容积负荷达到225±25mgN/(L·d),约为22±1℃工况下脱氮负荷的68%,显著高于以往研究结果。利用16SrRNA基因高通量测序和主成分分析的方法对反应器内功能微生物菌群进行分析,发现低温孵育对厌氧氨氧化生物膜上的微生物群落结构的演替有显著的影响。典型厌氧氨氧化菌Candidatus＿Kuenenia对低温环境的适应性高于Candidatus＿Brocadia和Candidatus＿Jettenia。低温孵育后Candidatus＿Kuenenia占比的提高和低温代谢能力的增强,对于提升厌氧氨氧化反应器在10～15℃时低温的脱氮性能具有重要作用。     

联氨氧化酶初步纯化及醌类化合物对其活性影响

厌氧氨氧化菌是一种化能自养菌,它具有独特的生理生化特性及生物脱氮机理.对厌氧氨氧化菌进行实验室扩大培养,对其主要代谢酶联氨氧化酶性质进行研究,对联氨氧化酶进行初步纯化,并探究醌类化合物对联氨氧化酶活性的影响.最终得出联氨氧化酶活性最适温度为35℃,最适pH为7.5.酶纯化结果表明超滤相对分子质量在50～100 kDa.投加辅酶Q对提高酶活性效果最好,2-羟基-1,4-萘醌对酶活性提高效果稍差,蒽醌-2-磺酸钠盐对酶活性基本无影响.     

垃圾渗滤液中有机物对其厌氧氨氧化的影响

为了考察垃圾渗滤液中有机物对其厌氧氨氧化反应的影响,保证晚期垃圾渗滤液的深度脱氮,采用短程硝化SBR联合厌氧氨氧化SBR(ASBR)两级系统处理氨氮为(2 000±100)mg/L、COD为(2 200±200)mg/L的实际晚期垃圾渗滤液进行试验研究.短程硝化SBR运行了100d,亚硝酸盐积累率达到了95%以上.ASBR采用进水逐步加大渗滤液掺入比例的方式进行驯化.实验结果表明,随着掺入比例的增大,进水可降解COD增加到150 mg/L左右时,ASBR的氮负荷速率从1.20 kg/(m3·d)降到了0.28 kg/(m3·d),氮去除速率从1.10 kg/(m3·d)下降到了0.19 kg/(m3·d),表明系统趋于崩溃.当ASBR进水可降解COD再次降低到50 mg/L左右时,系统的厌氧氨氧化菌活性得到了恢复,最大的氮负荷速率和氮去除速率分别达到了1.55和1.20 kg/(m3·d).定量PCR试验表明,当系统的厌氧氨氧化菌活性得到恢复后,厌氧氨氧化菌占全细菌的比例达到了试验期间的最大值1.94%.     

废水生物脱氮技术研究进展

介绍了几种新型脱氮工艺,主要包括短程硝化反硝化、氧限制自养硝化反硝化(OLAND)、全程自养脱氮(CANON)、厌氧氨氧化、同步反硝化脱磷除硫等工艺。它们以亚硝化反应和厌氧氨氧化反应为主,使脱氮具有更加低能耗、高效率的特点。微生物种类的扩展,厌氧氨氧化和反硝化反应的竞争,羟氨转化为联氨是厌氧氨氧化菌活性出现的标志等是最新的研究内容,但新型脱氮工艺的影响因素与控制方略,特别是相关物质转换,微生物学机理有待进一步研究。     

生物脱氮新技术

介绍了新近开发出的一些污废水生物脱氮新技术。这些新型生物脱氮工艺是基于新的氮素转化微生物及新的氮素转化途径，如短程硝化-反硝化、同时硝化-反硝化、厌氧氨氧化、好氧反氨化生物脱氮等。     

组合式厌氧折流板反应器处理城市污水的研究

在组合式厌氧折流板反应器(CABR)内置组合填料，采用厌氧活性污泥直接挂膜的方法启动了该反应器并对城市污水进行生物处理，研究了反应器启动过程中生物膜的生长情况及氨氮、COD、BOD的去除效果。     

半硝化-厌氧氨氧化法的脱氮研究

研究采用一种新的工艺——半硝化-厌氧氨氧化法来处理高浓度氨氮废水。半硝化在35℃左右,pH值为7．6左右,水力停留时间为1d的条件下反应;厌氧氨氧化在35℃,pH值为7．5左右,水力停留时间为2d的条件下反应。硝化反应对氨氮的有一定去除效果,但没有同等比例的亚硝酸盐氮生成;厌氧氨氧化反应前期氨氮、亚硝酸盐氮的去除率均可达到55％以上,但后期氨氮没什么去除效果,而亚硝酸盐氮有一定的去除率。     

Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea

The availability of fixed inorganic nitrogen (nitrate, nitrite and ammonium) limits primary productivity in many oceanic regions. The conversion of nitrate to N2 by heterotrophic bacteria (denitrification) is believed to be the only important sink for fixed inorganic nitrogen in the ocean. Here we provide evidence for bacteria that anaerobically oxidize ammonium with nitrite to N2 in the world's largest anoxic basin, the Black Sea. Phylogenetic analysis of 16S ribosomal RNA gene sequences shows that these bacteria are related to members of the order Planctomycetales performing the anammox (anaerobic ammonium oxidation) process in ammonium-removing bioreactors. Nutrient profiles, fluorescently labelled RNA probes, 15N tracer experiments and the distribution of specific 'ladderane' membrane lipids indicate that ammonium diffusing upwards from the anoxic deep water is consumed by anammox bacteria below the oxic zone. This is the first time that anammox bacteria have been identified and directly linked to the removal of fixed inorganic nitrogen in the environment. The widespread occurrence of ammonium consumption in suboxic marine settings indicates that anammox might be important in the oceanic nitrogen cycle.     

氨氮厌氧氧化的微生物反应机理

推导了以ＮＨ＾＋４作为电子供体,以ＮＯ＾－２、ＮＯ＾－３为电子受体,在厌氧条件下,氨氮生物氧化反应的计量方程式,并对细胞ＣαＨβＯεＮδ＝ＣＨＯＮ时的情形进行了讨论,从理论上明确了氨氮厌氧生物氧化反应的一些重要特征。     

有机碳源环境下的厌氧氨氧化批式实验

通过厌氧氨氧化批式实验,研究了在有机碳源环境下COD/NH4 -N比、pH值以及NO2--N浓度对厌氧氨氧化反应的影响.结果表明:在有机碳源环境下,厌氧氨氧化作用和反硝化作用可以同时存在;适宜的COD/NH4 -N比值范围在0~1.57之间;适宜的pH值范围应该在6.02~8.50之间,最适pH值为8.00;为了得到较好的脱碳和脱氮效果,在初始COD值为300mg/L时,初始NO2--N浓度不宜超过500mg/L,否则会抑制厌氧氨氧化反应和反硝化反应的进行.     

有氧条件下ANAMMOX反应及其在HABR反应器中实现

为了深入研究厌氧氨氧化(ANAMMOX)新型生物脱氮工艺,减轻水体氮素污染,防止水体富营养化,用无纺布填料进行了ANAMMOX细菌的培养和富集,并通过批式实验研究了DO存在时ANAMMOX反应的可行性及其在HABR反应器中的运行性能. 实验结果表明,在有氧条件下能够发生ANAMMOX反应,反应器中同时存在好氧氨氧化菌和厌氧氨氧化菌的协同作用. DO浓度为1.0～6.47 mg/L时,ANAMMOX细菌活性较低,NH 4-N和NO-2- N降解速率分别为1.52 mg/(L·h)和1.83 mg/(L·h);当DO浓度小于1.0 mg/L时,ANAMMOX细菌活性升高,降解速率分别达到3.40 mg/(L·h)和3.98 mg/(L·h). ANAMMOX工艺可以在HABR反应器中实现,受DO、温度等因素的影响,TN去除负荷较低,只有0.01 kg/(m3·d).     

N2 production by the anammox reaction in the anoxic water column of Golfo Dulce,Costa Rica

In oxygen-depleted zones of the open ocean, and in anoxic basins and fjords, denitrification (the bacterial reduction of nitrate to give N2) is recognized as the only significant process converting fixed nitrogen to gaseous N2. Primary production in the oceans is often limited by the availability of fixed nitrogen such as ammonium or nitrate, and nitrogen-removal processes consequently affect both ecosystem function and global biogeochemical cycles. It was recently discovered that the anaerobic oxidation of ammonium with nitrite--the 'anammox' reaction, performed by bacteria--was responsible for a significant fraction of N2 production in some marine sediments. Here we show that this reaction is also important in the anoxic waters of Golfo Dulce, a 200-m-deep coastal bay in Costa Rica, where it accounts for 19-35% of the total N2 formation in the water column. The water-column chemistry in Golfo Dulce is very similar to that in oxygen-depleted zones of the oceans--in which one-half to one-third of the global nitrogen removal is believed to occur. We therefore expect the anammox reaction to be a globally significant sink for oceanic nitrogen.