生命科学用原子力显微镜之原理与应用

本文在简单介绍原子力显微镜（AFM）成像原理及其特点的基础上，主要从AFM对核酸、蛋白质和细胞微生物的表面特性、内部结构、分子细胞间的相互作用及其动态观察、单分子操纵以及分子识别等方面的应用加以举例介绍。随着科学技术的发展，AFM的不断改进与完善，AFM必将成为生命科学研究的重要手段之一。     

基于纳米通道分析技术的电流检测系统

<正>纳米通道单分子检测技术受启发于Coulter计数法与单通道离子电流测量技术,自被提出以来得到了迅速的发展,受到了国内外广泛关注.作为一种研究单个分子行为的技术手段,纳米通道技术已经应用于研究DNA损伤、分析单个多肽结构及蛋白质构型、探测识别单个DNA与靶分子间相互作用、有机小分子化合物和水体中金属离子超灵敏检测等方面,通     

pBR322质粒DNA的原子力显微镜成象及剪切研究

研究DNA分子间和分子内相互作用力,可以帮助人们了解DNA分子的结构及其功能.由于对这些相互作用力进行直接测量时,不仅需要控制体系的稳定性,同时外加作用力又不能对体系产生影响.因此,目前只是利用X射线,光散射和核磁共振等手段对作用力进行直接的物理或热力学测量.虽然渗透压技术已经应用到DNA双螺旋非特定分子间力的测量,但对于具有特定取向的复杂分子相互作用,就需要在单个分子间进行直接测量.原子力显微镜(AFM)可以检测到10~(-14)N数量级的针尖-样品相互作用力,横向分辨率可达0.01nm,而接触面积只有10nm~2,并且可以在近生理溶液条件下操作,因此它是非常适合研究DNA分子间相互作用力的.事实上,利用AFM研究Biotin-streptavidin体系中的单个分子间相互作用以及DNA双链间的相互作用力已有报道.     

AFM单分子力谱技术测量膜蛋白力学特性的研究进展

膜蛋白在细胞生理活动中起着关键性的作用,是大部分药物的作用靶点.对膜蛋白进行研究不仅对理解生命活动的本质有着重要的价值,还可为疾病治疗和医药研发带来帮助.原子力显微镜(AFM)的出现为研究膜蛋白的结构提供了一种新的技术手段.AFM不仅可以对单个天然态膜蛋白分子的形貌结构进行高分辨率成像,同时还可通过将配体分子修饰到AFM针尖,利用单分子力谱(SMFS)技术对膜蛋白生理功能与活动行为(如配体结合、解折叠)中的力学特性进行直接测量,使得人们可以从分子生物力学方面来认识膜蛋白的结构和功能,是对传统结构生物学方法得到的蛋白质静态三维结构的重要补充.SMFS技术在测量膜蛋白力学特性方面取得了巨大的成功,为生命科学和医药卫生领域相关问题的解决提供了新的思路.本文结合作者在AFM病理瘤细胞表面抗体-抗原相互作用力测量方面的研究工作,介绍了SMFS技术的原理与方法,总结了近年来应用SMFS技术研究膜蛋白力学特性的进展,讨论了SMFS技术面临的挑战.     

植物重要膜蛋白的扩散与胞吞机制

膜蛋白作为细胞膜的重要组成部分,通常会发生胞吞循环以调控其在细胞膜上的数量平衡,或响应外界环境的刺激.单分子成像技术是近年来发展起来的,可用于在活细胞条件下对单个分子进行观测和研究的新技术,具有较高的时空分辨率,实现了在纳米和微秒水平上对单个分子的快速实时成像和精确分析.本文结合作者所在实验室取得的研究成果,介绍了利用单分子技术,包括全内反射荧光显微术、荧光相关光谱、荧光互相关光谱分析等方法,对植物几种重要膜蛋白在质膜上的运动特征以及胞吞途径的研究工作,总结了植物中脂筏微区分布及脂筏参与的胞吞途径对膜蛋白功能的调控机制,展望了植物质膜微区的精确划分以及膜蛋白胞吞之后的去向等方面所面临的难题.     

固态纳米孔中DNA分子再捕捉的探测和分析

<正>基于纳米孔的单分子测控技术有望为实现廉价而快速的个体基因测序提供关键的物理基础.固态纳米孔因其与现代微加工技术兼容及可实现器件高度集成而尤其受到关注.然而,利用固体纳米孔实现单个DNA分子的测序目前仍有几个关键的困难需要克服.其一即为单个DNA分子在纳米孔中运动的控制.通过对单个DNA分子的再捕捉可以揭示其在纳米孔中的动力学特征,并且通过进一步发展该技术将有望在碱基分辨中显著提高信     

快速与精确的AFM探针模型重构研究

在AFM扫描成像中,由于探针具有展宽效应等因素,导致扫描图像失真.从数学形态学角度看,可以认为真实图像失真是受到了探针针尖形貌卷积的作用,因而不能反映样品表面的真实形貌.采用反卷积运算处理可以排除这类扫描成像干扰,但需要准确知道探针针尖形貌,这对于AFM纳米扫描图像的精确重构具有实际意义.在已有的探针建模算法中,基于数学形态学的盲建模算法得到了广泛使用,然而该算法存在运算时间较长,最优降噪门限阈值很难确定等问题.针对这些问题,提出一种新的盲建模方法,可以提高盲建模运算速度,并且实现AFM扫描图像的精确重构.仿真和实验结果证明了上述研究方法的可行性和有效性.     

快速与精确的AFM探针模型重构研究

在AFM扫描成像中, 由于探针具有展宽效应等因素, 导致扫描图像失真. 从数学形态学角度看, 可以认为真实图像失真是受到了探针针尖形貌卷积的作用, 因而不能反映样品表面的真实形貌. 采用反卷积运算处理可以排除这类扫描成像干扰, 但需要准确知道探针针尖形貌, 这对于AFM纳米扫描图像的精确重构具有实际意义. 在已有的探针建模算法中, 基于数学形态学的盲建模算法得到了广泛使用, 然而该算法存在运算时间较长, 最优降噪门限阈值很难确定等问题. 针对这些问题, 提出一种新的盲建模方法, 可以提高盲建模运算速度, 并且实现AFM扫描图像的精确重构. 仿真和实验结果证明了上述研究方法的可行性和有效性.     

基于AFM 单分子力谱技术的CD20-Rituximab 间相互作用力测量

原子力显微镜(AFM)的发明为测量分子间特异性相互作用力提供了新的技术手段.利用AFM 单分子力谱 (SMFS) 技术分别测量了提纯的CD20, 淋巴瘤Raji 细胞表面的CD20 和淋巴瘤病人B 细胞表面的CD20 与Rituximab (抗CD20 单克隆抗体)之间的相互作用力. 通过探针功能化技术, 将Rituximab 连接到AFM针尖; 通过基底功能化技术, 将提纯的CD20分子吸附到云母表面, 对CD20分子进行了AFM成像, 并测量了CD20与Rituximab 之间的相互作用力; 通过静电吸附和化学固定, 将淋巴瘤Raji 细胞和淋巴瘤病人细胞固定到载玻片表面, 对Raji 细胞和病人细胞进行了AFM 成像, 并分别测量了Raji 细胞表面的CD20 和病人B 细胞表面的CD20 与Rituximab 之间的相互作用力. 比较并分析了在提纯的CD20 分子表面、Raji 细胞表面和病人B 细胞表面测量CD20-Rituximab 相互作用力的差异,实验结果表明Raji 细胞表面的CD20 与Rituximab 之间的相互作用力明显小于提纯的CD20 以及淋巴瘤病人B 细胞表面的CD20 与Rituximab 之间的相互作用力, 为深入研究造成Rituximab 耐药性差异的分子机理提供了技术思路和实验方法.     

DNA损伤修复的单分子水平研究进展

外源或内源的DNA损伤在生物体内持续发生。DNA损伤修复的缺陷与很多疾病甚至癌症等息息相关,而生物细胞进化出一系列精密的修复机制以耐受或切除这些损伤。单分子技术区别于常规的生化、分子生物学等手段,可以在体外和活细胞内研究DNA修复相关生物分子的动态反应特征,从而对DNA修复机制进行更充分的剖析。文章围绕常见的DNA损伤及其修复类型,阐述了近年来利用原子力显微镜、磁镊、光镊等单分子操控技术,以及全内反射荧光显微镜、光激活定位显微镜和超分辨显微示踪等单分子荧光成像技术在DNA修复机制研究中取得的进展,梳理了利用单分子技术解决的长期存在的关于DNA修复难题,并展望了单分子技术联合其他交叉学科技术在研究DNA修复机制方面的前景。     

用单分子荧光显微术与光学作图法构建水稻BAC克隆DNA的限制性物理图谱

报道一种用于荧光显微镜探测的研究DNA分子与限制性内切酶相互作用的方法。DNA分子经过改进的“分子梳”技术铺展并吸附于化学修饰过的盖玻片表现，然后运用限制性内切酶EcoRⅠ进行原位酶切反应，使DNA分子在固着状态下的反应结果与液相反应相对应，通过单分子荧光显微术直接观测并记录单个DNA分子的酶切反应结果，成功地构建了水稻BAC克隆DNA的限制性物理图谱，为单分子的动态荧光显微镜实施研究和基因组光学作图打下基础。     

基于纳米孔道的单分子时间组学

纳米孔道技术以其与单个分子尺寸匹配的、化学环境精准可控的传感界面以及逐个读取单个分子的特征,兼具高空间分辨特性、单分子特性和高通量特性.本文结合这三个特性,探讨了纳米孔道构建“单分子时间组学”的潜在优势与挑战.     

退火时间对二维DNA晶体自组装的影响

DNA自组装的过程,不仅需要合适的缓冲液,还需要适当的退火时间.本文利用DNA自组装技术,以反向平行双交叉(double-crossover,DX)DNA分子瓦(DNAtile)作为建筑模块,带有互补黏性末端(sticky-ends)的分子瓦依据Watson-Crick碱基互补配对原则配对连接,成功制备出二维晶体结构.比较不同退火时间下形成的DNA分子瓦结构,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-denaturing PAGE)表征.结果表明,退火时间为2.5h时形成的分子瓦的结构较稳定.等量混合此条件下形成的不同分子瓦,分别从50,37和25℃退火至室温,利用原子力显微镜(AFM)对退火后的结构进行表征,结果表明,起始退火温度为37℃时得到的DNA二维晶体较平整.     

基于AFM的淋巴瘤细胞成像及其机械特性测定

原子力显微镜(AFM)以其独特的成像方式, 为在细胞水平和分子水平获取细胞生理状态的新认识提供了技术手段. 研究了近生理环境下基于AFM的Burkitt淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma, BL)细胞成像及其机械特性的测定, 探索了基于多聚赖氨酸的悬浮细胞固定方法, 并在此基础上实现了AFM对BL细胞表面形貌及其超微结构的高分辨率成像; 对活体BL细胞以及戊二醛固定后的BL细胞的机械特性进行了测定, 验证了Hertz模型对BL细胞机械特性描述的有效性, 同时揭示了戊二醛的引入将导致BL细胞硬度的显著增加. 实验结果为近生理环境下悬浮细胞的高分辨率形貌表征和机械特性测定提供了技术思路和实验方法, 同时为在单细胞尺度上探索可用于疾病早期快速诊断和个性化治疗的新生物标记奠定基础.     

数字体图像相关方法研究进展

数字体图像相关方法是可测量物体内部三维全场变形的先进实验力学方法.通过匹配由数字体成像设备获取的被测物体变形前后的两组数字体图像,该方法能够获得物体内部亚体素精度的三维位移场和全场应变.得益于新型体成像设备的不断涌现、图像配准算法的持续改进以及高性能并行计算技术的快速发展,数字体图像相关方法已在生物医学、固体力学、岩土力学、材料科学等领域获得许多令人瞩目的重要应用.本文对过去20多年数字体图像相关方法中出现的各种位移和应变测量算法进行了系统回顾和评述,分析了该方法当前的局限和所面临的挑战.可以预期,数字体图像方法在实验力学领域中将扮演更为重要的角色,并有望在更多科研和工程领域中获得应用.     

单分子电子学的实验研究进展及未来10年展望:从器件到应用

单分子电子学的初衷是采用单个分子这种极致尺寸结构精确可控的材料作为电子器件的功能单元,以此来应对半导体器件尺寸的小型化进程.从第一次实验测试到单分子电导开始,单分子电子学经历了25年的发展,逐渐衍生出两条研究路线:一条是延续该领域的初心,通过采用单个分子构筑半导体器件,进而实现逻辑运算乃至分子计算芯片;另一条是开辟新的研究领域,采用单分子电子学技术作为单分子尺度物理化学过程的表征方法和研究工具.本文沿着单分子电子学的发展脉络,简述单分子电子学领域的重要研究进展,并对该领域未来发展趋势及所面临的挑战进行展望.     

基于纳米操纵的DNA分子手术

手术一般是利用手术刀等工具对生物体的特定部位进行定位机械操作,包括切割、移植、缝合等."分子手术"是延用医学中对生物体外科手术的概念,只是对象不是生物体而是单个分子."分子手术"的定义为:对单个分子在纳米尺度上的操纵和改性,包括对单分子的切割、推移、卷积、分离,以及定位反应等.这意味着分子手术主要是借助某种机械对单个分子的机械操作及随之引发的化学和生化反应.     

基于分子瓦自组装的DNA纳米管的制备与表征

利用DNA分子自组装技术可以构建从一维到三维不同形状的纳米结构,并且这些结构在微纳米电子学、纳米生物学等众多领域有许多潜在的用途.本文利用DNA分子瓦(tile)自组装技术,采用双交叉(DX)DNA分子瓦成功组装了一维DNA纳米管结构,聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)、透射电子显微镜(TEM)、荧光显微镜和原子力显微镜(AFM)对制得的DNA纳米管结构进行了表征,结果表明,组装成功的DNA纳米管直径在7～20nm之间,长度最长可以达到50μm以上.为了结构更加稳定,对分子瓦中每条DNA单链的5′末端进行磷酸化处理,自组装完成后利用T4DNA连接酶连接磷酸化修饰的DNA纳米管的缺口.AFM结果显示,使用T4DNA连接酶处理后的DNA纳米管更能保持完好的管状结构,表明连接处理后的DNA纳米管更加坚固,促进了DNA纳米管应用于微纳米领域的研究.     

重组DNA的研究新进展

本世纪70年代初,美国科学家S. Cohen和H. Boyer等首次在体外成功地组建了具有生物功能的重组质粒,1974年,Morrow等将第一个真核基因即瓜蟾rRNA基因导入大肠杆菌,获得克隆,标志着重组DNA(rDNA)研究的开始。rDNA技术,是在试管内用酶及其他物质使不同物种间的DNA分子彼此结合,然后导入细胞内令其行使功能的技术。它涉及五个方面:1)DNA特异的剪切技术——获取目的基因;2)核酸分子杂交技术——鉴定未知核酸分子;3)DNA的分子克隆——目的基因的扩增;4)DNA顺序测定——确立基因的精细结构和功能的关系;5)目的基因的表达——产     

RNA聚合酶动态调控DNA转录的单分子水平研究进展

真核生物的RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)和原核生物的RNA聚合酶(RNAP)主要负责转录合成信使RNA(mRNA)，调控不同基因的转录水平，以调节生物体的生长发育和应对复杂多变的环境。研究者采用传统的荧光显微镜观测到RNAP可形成团簇，据此针对DNA转录调控提出“转录工厂”模型。随着单分子技术的发展，研究者在单分子水平上观测到了活细胞中RNAP动态调控DNA转录，提出RNAP可以通过液-液相分离机制进行转录调控。该综述总结了不同单分子荧光显微镜的技术原理，以及相关的荧光探针标记方法，并介绍了在真核生物和原核生物中应用单分子成像技术可视化RNA聚合酶动态调控DNA转录过程的研究进展，最后展望了单分子技术在转录调控研究中的应用前景。