γ干扰素工程菌发酵工艺研究

在摇瓶培养及恒化培养研究的基础上,对含温度敏感型质粒γ干扰素工程菌高密度、高表达的发酵工艺作了探讨。摇瓶培养结果表明,菌体的良好生长状态对外源基因表达起着重要作用,工程菌于对数后期升温,干扰素滴度最高。以葡萄糖为限制性基质的恒化培养,得出了工程菌细胞生长得率与比生长速率之间的关系,同时表明工程菌升温表达前的比生长速率对表达后干扰素的比活有影响,比生长速率在0.10～0.15h~(-1)时比活最大。通过碳、氮、镁的间歇流加培养与连续流加培养,均使工程菌达到高密度与高表达,但以控制比生长速率为目的的连续流加培养较间歇流加比活提高近4倍,棕1.1×10~(10)IU/L。     

流加不同物质对大肠杆菌DB15(pAET-8)表达人表皮生长因子的影响

考察了在大肠杆菌DB15(pAET-8)表达人表皮生长因子(hEGF)过程中流加不同的物质——磷酸盐、蛋白胨和酵母抽提物等对人表皮生长因子表达的影响.在表达阶段单独流加磷酸盐虽然增加了表达初期的比生长速率,延长了菌体生长期,提高了菌体浓度,但hEGF产量却比对照组减少了57%.在表达阶段流加蛋白胨或酵母抽提物也未能提高hEGF的表达水平.表明氨基酸或核苷酸合成并不是hEGF表达的限速步骤,提高大肠杆菌DB15(pAET-8)合成三磷酸腺苷(ATP)的能力或许是提高hEGF表达的关键.     

酵母生产培养基指数流加的研究

本文根据酵母生长规律和指数流加的原理,通过对限制性废物和菌体作物料平衡,推导出培养基指数流加数学模型,即:integral from 0 to t(μ/Ye/s+m)_S_0~C_0 e~(μt dt).在实验室条件下,对该模型进行了验证,结果证明,该模型正确,且对面包酵母生产有一定的实用价值.     

Aspergillus sp. Li-38产脂肪酶发酵条件及催化反应的初步研究

对自行筛选的曲霉菌株Aspergillus sp.Li-38的发酵条件进行研究。通过考察不同碳源和氮源对产酶的影响,获得曲霉脂肪酶的优化摇瓶培养基成分,菜籽油1.5%(V/V),蛋白胨3%(W/V),NH4SO41%(W/V),K2HPO40.1%(W/V),MgSO4.7H2O,0.1%(W/V)。研究表明菜籽油对产酶具有明显的诱导作用,复合氮源比单一氮源更利于菌体产酶,优化后酶活可达42U/mL,与优化前相比提高了1.6倍。利用该脂肪酶催化棉籽油合成生物柴油研究表明,二步流加甲醇的反应体系其酯化率可达到59%。     

碳及氮源在提高重组酵母表达分泌水平中的作用

通过摇瓶批式发酵方法和2L发酵罐补料分批发酵方法研究了碳及氮源在提高重组酵母S。cerevisiae 20B-12(pNA3)表达分泌水平中的作用,得出采用分段发酵方法,在诱导期补充替代碳源（乳糖或甘油）并以营养丰富的天然氮源（酵母膏）诱导产物分泌可使重组酵母表达、分泌水平有较大提高。在补料分批培养中通过生长阶段加速补充碳源,产酶阶段补充替代碳源和分次补加酵母膏的方法使重组酵母表达、分泌水平进一步提高,从而为流加培养和工业化放大提供了依据。     

多菌灵降解菌GRPD-1的分离鉴定及降解特性研究

从成都彭州蔬菜基地土壤中分离得到1株能以多菌灵作为唯一碳氮源生长的细菌,命名为GRPD-1.经形态观察、生理生化实验以及16S rDNA基因同源性序列分析,鉴定其为假单胞菌属(Pseudo-monas sp.).研究了该菌株在不同pH值、温度、接种量和外加碳氮源条件下对多菌灵降解效果的影响.实验结果表明,该菌株在以多菌灵为唯一碳氮源的基础盐培养基中培养6 d,对50 mg/L多菌灵的降解率达到60%.添加少量葡萄糖、蛋白胨作额外碳氮源时可促进菌株GRPD-1对多菌灵的降解,第2天的降解率提高到90%以上.其最适降解条件为pH值7.0,温度30℃,接种量9%.研究结果表明菌株GRPD-1在农药污染的土壤修复方面具有广阔的应用前景.还考察了菌株在不同碳氮源生长条件下产生的蛋白酶的试验,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,初步分析了酶谱条带,发现菌株在不同碳氮源生长条件下表达的蛋白酶有差异.     

红发夫酵母生产虾青素的氮源补加策略

随着人类对天然虾青素需求的不断扩大,红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)以其易于培养的优点被选为当前虾青素生产极具潜力的微生物.实验主要从氮源调控入手,阐明虾青素生产机制,以期获得更高的虾青素产量.在微生物生长过程中,氮源的调控对细胞的生长和产物的积累至关重要.考察了在红发夫酵母生长过程中添加氮源对细胞生长及虾青素合成的影响.实验结果表明:补加不同种类的氮源及浓度对菌体生物量以及虾青素的产量有着不同的影响,在合适的时间点补加适量的氮源能明显促进虾青素的积累.根据实验结果,研究确定了最适的补氮时间为24h,最适的补加氮源为谷氨酸,最适的补加质量浓度为0.368g/L,在此补加条件下,虾青素的最大产量和产率分别为3.445mg/L和1.144mg/g,较对照组分别提高了36%和41%,这说明在细胞生长过程中补氮有利于虾青素的积累.     

氮源对重组枯草芽孢杆菌24/pMX45核黄素发酵的影响

考察了无机氮源NH4Cl和不同有机氮源对重组枯草芽孢杆菌24/pMX45核黄素发酵的影响.实验结果表明,NH4Cl作为基础氮源对菌体生长和核黄素合成均有抑制作用.采用不同有机氮源进行核黄素发酵,以酵母粉为氮源时发酵单位最高,而蛋白胨为氮源时核黄素发酵单位最低.     

不同流加发酵方式对重组枯草芽孢杆菌生产维生素B2的影响

在5 L发酵罐中培养重组枯草芽孢杆菌RH33生产核黄素,该重组菌的染色体上含有多个解除了转录调节的核黄素操纵子．由于过高的初糖浓度导致严重的代谢溢流,因此间歇发酵过程只能得到较低的菌体量和产物产量．分别采用了3种不同的流加培养方式：分批流加、恒速流加和葡萄糖限制流加来减弱代谢溢流并提高核黄素的产量．同间歇培养相比,分批流加培养能微弱提高重组菌的核黄素产量,而恒速流加和葡萄糖限制流加均能显著提高菌体量和核黄素产量．对于恒速流加培养,当流加速率为0．48 mL／min时核黄素产量和菌体量可以分别达到9．8g/L和27．3g/L对于葡萄糖限制流加培养,通过人工控制葡萄糖流加速率使培养基中的葡萄糖浓度为10～2 g/L时,重组菌RH33可以达到最高的核黄素产量和菌体量(分别为12．5g/L和34．7g/L)．在葡萄糖限制流加培养中核黄素产率约为0．06 g(核黄素)／g(葡萄糖),高于其他几种培养方式．     

重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

采用Mut^s表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油—甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g／L,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mmol／L时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH调节方式并在发酵后期添加25mmol／L(NH4)2SO4使发酵液中铵离子浓度维持在150mmol／L以上,血管生长抑制素的表达产量达到108mg／L。     

乳酸菌USTB--08的高效培养和生产乳酸

在成功筛选出一株高产乳酸的乳酸菌USTB--08基础上,分别采用批量和补料发酵培养,通过改变碳源、氮源、碳氮比、温度和pH值等研究了乳酸菌USTB--08生长和产乳酸的优化控制条件.采用蔗糖和酵母膏作为唯一碳源和氮源（碳氮质量比为5∶1）、温度35℃、接种量1.0%及初始pH 6.50是提高乳酸菌生长的优化参数.进一步在50L全自控发酵罐中,采用质量分数为10%氢氧化钠和25%蔗糖混合溶液作为控制pH值和碳源补料的流加液,在pH 6.00～7.00范围内,恒定控制pH 6.50获得了最大的乳酸菌生物量（OD680nm 13.2）,而恒定控制pH 7.00则获得了最高的乳酸含量（28.0 g.L-1）.本研究首次采用控制pH值与流加蔗糖同步进行的培养方式,获得了高细胞浓度的乳酸菌和高质量浓度的乳酸.     

黑芝菌丝体液体培养基的筛选

以黑芝菌丝体生物量为主要指标,首先对不同碳源和氮源进行单因素初选试验,然后进行不同比例混合碳氮源正交试验.结果表明：黑芝菌丝体液体最佳培养基是蔗糖20 g/L、麦芽糖15 g/L、麦麸20 g/L、酵母粉1.5 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L和VB16 mg/L,其菌丝体生物量产率为35 g/L.     

正交设计法筛选槐耳菌丝体液体培养基的研究

以槐耳菌丝体生物量为主要指标,采用不同碳源和氮源进行单因素初选试验,然后以不同比例的混合碳氮源进行正交试验．结果表明,槐耳菌丝体液体最佳培养基是玉米渣200g／L,蔗糖20g／L,酵母膏3g／L,麦麸3．5g／L,KH2PO42．0g／L,MgSO4·7H2O1．0g／L和VB1 6mg／L,温度28℃,pH自然．其菌丝体生物量得率为21．6g／L．     

利用溶氧作为控制信号补料分批培养生产PHA的研究

利用已构建的工程菌Escherchia coli XL1-Blue(pKSABC),在20L自动发酵罐里进行补料分批培养。研究表明,底物浓度、温度、pH、DO等参数是影响菌体生长和PHA积累的重要因素;通过补料分批培养可以提高PHA的积累量。通过对DO在发酵过程中的变化规律的分析,确定DO作为补料时间的在线控制信号。补料的原则是,使发酵前期菌体大量生长,发酵后期PHA大量积累。在优化条件下,对工程菌Escherchia coliXL1-Blue(pKSABC)进行了60 h的补料分批培养,菌体浓度、PHA浓度和PHA占细胞干重的百分比分别为179g/L,132g/L,73.7%。     

Studies on optimization of nitrogen sources for astaxanthin production by Phaffia rhodozyma

Fermentation of Phaffia rhodozyma is a major method for producing astaxanthin, an important pigment with industrial and pharmaceutical application. To improve astaxanthin productivity, single factor and mixture design experiments were used to investigate the effects of nitrogen source on Phaffia rhodozyma cultivation and astaxanthin production. Results of single factor experiments showed nitrogen source could significantly affect P. rhodozyma cultivation with respect to carbon source utilization, yeast growth and astaxanthin accumulation. Further studies of mixture design experiments using (NH₄)₂SO₄, KNO₃ and beef extract as nitrogen sources indicated that the proportion of three nitrogen sources was very important to astaxanthin production. Validation experiments showed that the optimal nitrogen source was composed of 0.28 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.49 g/L KNO₃ and 1.19 g/L beef extract. The kinetic characteristics of batch cultivation were investigated in a 5-L pH-stat fermentor. The maximum amount of biomass and highest astaxanthin yield in terms of volume and in terms of biomass were 7.71 mg/L and 1.00 mg/g, respectively.     

Pseudomonas sp. QG6降解喹啉过程中除磷特性及影响因素研究

从工业废水处理系统中分离出一株以喹啉为唯一碳源和氮源的假单胞菌QG6 (Pseudomonas sp. QG6), 用于喹啉降解同步除磷, 并采用正交实验设计优化出最佳条件。菌株QG6具有较好的喹啉降解能力, 12小时内能将96~144 mg/L的喹啉完全降解。菌株QG6在好氧条件下具有除磷能力, 不存在喹啉的条件下, 以有机碳为碳源、无机氮为氮源、初始磷酸盐浓度为8.69~19.41 mg/L时, 20小时内能去除磷酸盐86%以上。初始喹啉浓度为144 mg/L (其自身的碳氮比约7:1)、磷酸盐浓度为10 mg/L时, 若不外加有机碳源, 喹啉在12小时内被降解完全, 同一时段内除磷率仅为33%。外加有机碳源至碳氮比20:1且其他条件都相同时, 喹啉降解 效果不受影响, 且同步除磷率提高到 86%。正交实验表明, 外加碳源条件下喹啉降解的最佳条件按影响大小排列为: 初始喹啉浓度200 mg/L, 温度25°C, pH 8, 摇床转速120 rpm; 除磷最佳条件为: 摇床转速100 rpm, 温度为25°C, 初始喹啉浓度150 mg/L, pH 9。     

缺氧段碳源浓度对反硝化聚磷的影响

为了提高反硝化除磷工艺的脱氮除磷效率,以反硝化除磷污泥为研究对象,采用静态试验进行对比研究,考察碳源浓度对缺氧反硝化聚磷的影响.结果表明:当缺氧段初始碳源浓度为10.0 mg/L时,亚硝酸盐积累严重,反硝化聚磷受到抑制;当缺氧段初始碳源浓度由24.6 mg/L上升至176.8 mg/L时,随着碳源浓度的增加,反硝化速率...     

高密度培养大肠杆菌TB1/pMAL-hOCIFm的优化条件

利用Bioengeering 3．7L自控式发酵罐,以分批培养和补料分批培养相结合的培养技术,高密度培养重组大肠杆菌TB1／pMAL-hOCIFm,生产重组人破骨细胞形成抑制因子成熟肽(recombinant human osteoclastogenesis inhibitory factor mature peptide,rhOCIFm)。通过对碳、氮源补加方式以及溶解氧等参数的控制,使工程菌E．coliTB1／pMAL-hOCIFm的发酵菌体OD600达到57．8,rhOCIFm与MBP融合蛋白(hOCIFm-MBP)的含量达到3．2g／L。本研究为工业化生产rhOCIFm奠定了基础。     

香菇UGPase酶活性及转录表达水平对不同碳氮源的响应

【目的】尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)是糖代谢途径中的关键酶,在生物体次生代谢产物合成过程中具有重要的作用,对其进行深入的研究,将有助于阐明糖代谢的分子机制。【方法】本实验以香菇新808为实验材料,设置不同的碳、氮源对香菇菌丝体进行液体发酵培养（25 °C,30天）,烘干菌丝体称取其生物量,利用苯酚-硫酸法测定菌丝体胞内多糖含量,通过荧光实时定量PCR检测不同碳氮源下菌丝体ugp基因的相对表达量,同时测定UGPase酶活性。【结果】结果表明,与普通PDA培养基比较,除以硝酸铵为氮源外,其余碳氮源均能提高香菇菌丝体生物量,其中以麦麸为碳源的生物量最大（0.63g）。以小分子糖（蔗糖、麦芽糖和甘露糖）为碳源、有机复合物（麦麸和黄豆芽）为氮源时,ugp基因表达量明显上调,UGPase酶活性更高,同时,其香菇菌丝胞内多糖的含量也更高。其中分别以蔗糖为碳源,以麦麸作为氮源时,ugp基因表达量、UGPase酶活性（分别为4043.80U/mg和3873U/mg）和菌丝胞内多糖含量（分别为3.60%和3.86%）最高,ugp基因表达量分别为对照组的8.19倍和6.52倍。【结论】香菇菌丝ugp基因转录表达水平、UGPase酶活性以及菌丝胞内多糖含量三者之间显示出较高的正相关性。小分子碳源（蔗糖、麦芽糖和甘露糖）、有机氮源（麦麸和黄豆芽）有助于香菇菌丝多糖的合成,其中蔗糖和麦麸可作为香菇液体发酵优势碳源和氮源。     

假单胞杆菌BC001对吡啶和喹啉的生物去除

从首钢焦化厂废水处理系统的活性污泥中分离出1株能在高浓度的吡啶（约400mg/L）和喹啉（约500mg/L）双基质条件下良好生长的细菌,经16S rDNA及生理形态特征鉴定为假单胞杆菌（Pseudomonas sp. BC001）,它对吡啶的去除主要通过生物吸附,而对喹啉的去除包括生物吸附和降解两个阶段。该菌能利用喹啉作为唯一的碳源和氮源代谢生长,适量的外加碳源对喹啉降解具有促进作用,经检测喹啉降解的中间产物主要为2-羟基喹啉和8-羟基香豆素, 氮的主要代谢终产物为NH₄⁺。