HLA-G抑制NK和T细胞介导的对猪内皮细胞的细胞毒作用

为了探讨HLA-G分子在异种器官移植中的应用前景，用RT-PCR方法从人胎盘组织中克隆了HLA-G cDNA， 构建了哺乳动物表达载体；通过稳定转染，获得了高效表达HLA-G蛋白的猪血管内皮细胞（PECs）克隆，经细胞毒实验发现，HLA-G不仅可以抑制活化人NK-92细胞对PECs的杀伤，其抑制水平达到或低于NK-92杀伤人脐静脉内皮细胞水平，而且可以抑制异种抗原特异T淋巴细胞的细胞毒作用，抑制率为59.1％-88.9％。因此认为HLA-G作为异种移植诱导免疫耐受的新策略，不仅在延迟性排斥阶段起到抑制NK细胞作用，而且在细胞性排斥阶段同样可以抑制T淋巴细胞作用。     

改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用

在延缓性免疫排斥反应(DXR)过程中, NF-κB发挥着关键作用. 如何恰到好处地抑制其活性是本领域研究的重要问题之一. 用改造的E1A基因(E1A)包括功能区(1 ~ 80氨基酸)和核定位区(139 ~ 243氨基酸), 删除其中可能对人体有害的CR2区, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中, 并转染猪血管内皮细胞(PAEC), 经G418筛选, 获得稳定表达细胞株. RT-PCR技术和细胞生长曲线分析, 证明E1AΔ基因能在PAEC中稳定表达, 且不影响细胞的正常生长, 并能抵抗肿瘤坏死因子-α (TNF-α)诱导的细胞凋亡. 报告基因分析表明, E1A(能抑制由TNF-α诱导的NF-κB活性, 其抑制率为53%, 对NF-κB信号转导途径下游的一个重要炎症基因--E-选择素基因的表达抑制率达63%. 综上, E1AΔ基因的这些功能基本符合异种器官移植中克服DXR的要求, 为利用E1AΔ基因克服DXR的可行性提供了实验依据.     

腺病毒介导的CTLA4-FasL基因转移预防小鼠自身免疫性糖尿病

抑制或删除自身免疫性T细胞对胰岛素生成细胞——β细胞的破坏可以有效预防1型糖尿病的发生. 研究表明CTLA4-FasL双功能免疫抑制分子可以抑制T细胞活化及促进T细胞的凋亡. 在多次小剂量(40 mg/kg)腹腔注射链脲佐菌素诱导的小鼠自身免疫性糖尿病模型中, 初次给予链脲佐菌素的同时, 经尾静脉输注(2 ~ 5)×10⁸ pfu/mL CTLA4-FasL腺病毒进行基因治疗后, 糖尿病的发病率显著降低(13%, n = 15), 血糖和胰岛素水平维持正常; 且显著诱导胰腺淋巴细胞凋亡及胰腺淋巴细胞IFN-γ与Vβ8.2 TCR的mRNA表达明显下降. 表明腺病毒介导CTLA4-FasL基因治疗, 有效诱导自身反应性T细胞凋亡, 提示其在预防自身免疫性糖尿病的潜在价值.     

CD4 T细胞转化的DN T细胞对小鼠EAE发病的预防

利用CD4 T细胞体外转化获得具有下调免疫作用的双阴性T细胞(DN T细胞),利用DN T细胞预防性治疗常规变态反应性脑脊髓炎(EAE)小鼠(Mus musculus)模型.观察EAE造模组和DN T细胞预防治疗组两组小鼠EAE评分、体重、关键淋巴细胞因子、组织切片的区别,探索DN T淋巴细胞发挥功能的可能机制.首先诱导获得了抗原特异性的DN T细胞;其次发现一次DN T淋巴细胞的过继输注可以显著降低EAE造模的发病程度,缓解小鼠因为EAE发病而造成的体重减轻;同时和造模组相比,DN T细胞预防组脑部组织淋巴细胞浸润略有减轻,血浆中IL-2和IL-4的分泌也有一定程度的降低;最后通过CFSE增殖实验证实DN T细胞可以显著抑制EAE模型中致炎CD4 T细胞的增殖.本研究证实体外转化的DN T细胞可以减轻EAE模型的发病程度,这种预防作用与DN T淋巴细胞可以抑制致炎CD4 T淋巴细胞的增殖相关.     

小鼠BRI3基因的克隆及其诱导细胞死亡的作用

为了阐明TNFα作用的分子机制，用抑制消减杂交（SSH）技术和反转录PCR（RT-PCR),从hTNFα处理过的小鼠脑血管内皮细胞（bEnd．3）总RNA中扩增并克隆BRI3的cDNA，构建了BRI3基因与绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合的表达载体pEGFP/I3，转染L929细胞后，发现EGFP／I3融合蛋白位于细胞质里，通过TUNEL法检测或流式细胞仪分析初步表明，该融合蛋白在L929细胞中的表达能够导致细胞死亡，而且这种细胞死亡能被L929细胞中表达的Bcl－2蛋白所抑制，提示BRI3基因的功能可能与TNFα的细胞毒作用有一定的相关性。     

抗乙型肝炎的一场温和战斗

长期以来,病毒学家已知道一种称之为细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocytes,CTLs)可以追捕受到感染的细胞并释放致死因子,将受染细胞及其所含的病毒杀灭。最近,研究者认识到这种免疫细胞还可采用一种较温和的杀伤方式,例如对付乙型肝炎病毒,这种淋巴细胞可以分沁某些因子,该因子可促进受染细胞破坏它自身所产生的病毒分子,而且这种活性在抑制感染的同时,对受染细胞本身产生伤害。     

κ改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α 诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用

在延缓性免疫排斥反应(DXR)过程中, NF-κB发挥着关键作用. 如何恰到好处地抑制其活性是本领域研究的重要问题之一. 用改造的E1A基因(E1AΔ)包括功能区(1 ~ 80氨基酸)和核定位区(139 ~ 243氨基酸), 删除其中可能对人体有害的CR2区, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中, 并转染猪血管内皮细胞(PAEC), 经G418筛选, 获得稳定表达细胞株. RT-PCR技术和细胞生长曲线分析, 证明E1AΔ基因能在PAEC中稳定表达, 且不影响细胞的正常生长, 并能抵抗肿瘤坏死因子-α (TNF-α )诱导的细胞凋亡. 报告基因分析表明, E1AΔ能抑制由TNF-α 诱导的NF-κB活性, 其抑制率为53%, 对NF-κB信号转导途径下游的一个重要炎症基因——E-选择素基因的表达抑制率达63%. 综上, E1AΔ基因的这些功能基本符合异种器官移植中克服DXR的要求, 为利用E1AΔ基因克服DXR的可行性提供了实验依据.     

恶性淋巴细胞增殖病细胞分化与基因重排研究

恶性淋巴细胞增殖病是淋巴细胞在不同分化阶段发生恶性转化造成克隆性增殖的常见病.常规形态学和组织细胞化学分析不能明确克隆性增殖的细胞起源及其分化阶段,而利用抗淋巴细胞分化抗原单克隆抗体(McAbs),则可以识别绝大多数恶性淋巴细胞增殖病的细胞分化起源,但还不能鉴定少数未分化肿瘤的细胞源性,更不能特异地识别恶性细胞.本研究将McAbs免疫酶标和体外基因扩增聚合酶链反应(PCR)技术结合起来分析淋巴细胞表面     

LIF, VEGF, CD57和CD68在大鼠胚胎移入小鼠子宫后的表达

种间妊娠失败是异种克隆的主要障碍. 为探讨种间妊娠失败的原因, 将大鼠囊胚移入假孕第3天的小鼠子宫内. 以前的研究显示, 大鼠胚胎只能在小鼠子宫内发育到第9天. 本实验结果表明, 异种胚胎移植后母胎界面CD57和CD68分子表达较同种移植的增强. 免疫组织化学和免疫印迹研究均显示, 异种胚胎移植后白血病抑制因子(LIF)表达增强, 但血管内皮生长因子(VEGF)表达下降. 在体外共培养系统中, 大鼠外胎盘锥在小鼠子宫蜕膜细胞上黏附率、扩展率和扩展面积较同种的显著降低. 这些结果提示, 大、小鼠种间妊娠中免疫排斥反应增强, 异种胚胎侵入能力降低, 可能是导致大、小鼠种间妊娠失败的重要原因.     

重组逆病毒介导的Immunocaspase-3分泌性T细胞对ErbB2阳性乳腺癌的杀伤作用

将Immunocaspase-3基因转染Jurkat T淋巴细胞, 使其稳定地分泌性表达靶向促凋亡蛋白Immunocaspase-3, 间接免疫荧光检测表明该蛋白可内化进入ErbB2阳性的SKBr3乳腺癌细胞, 细胞计数结果表明乳腺癌细胞的生长和增殖受到明显抑制. 进一步将Immunocaspase-3基因克隆入逆转录病毒载体pLNCX, 转染PA317细胞进行包装, 挑选高滴度的包装细胞株收获病毒. 用收获的病毒感染刺激分裂的人外周血T淋巴细胞, 经筛选后通过尾静脉注射给荷有SKBr3乳腺癌的裸鼠, 观察到肿瘤生长明显受到抑制(抑制率 73.25%), 裸鼠存活时间较对照组延长80.95%. 免疫组织化学染色结果表明裸鼠肿瘤组织中有Immunocaspase-3蛋白分布, TUNEL检测证实肿瘤细胞发生凋亡. 上述结果表明, T淋巴细胞分泌的Immunocaspase-3在裸鼠体内可以识别和进入ErbB2阳性的乳腺癌细胞, 抑制肿瘤生长.     

天然“抗癌细胞”的发现

免疫学家在寻找体内起免疫监视作用的细胞时,发现了多种具有不同功能的淋巴细胞.如果培养条件适宜的话,有些类型的细胞会杀伤其他类型的细胞,包括肿瘤细胞.这些细胞包括T 淋巴细胞亚群和“自然”杀伤细胞,所以称为自然杀伤细胞是因为它从血液或者淋巴组织中分离出来时处于有活性的细胞毒(细胞杀伤)状态,而毋需活化或免疫措施.几种细胞毒细胞成功地起着免疫监视的作用,然而尽管这些细胞在培养中能杀伤一些肿瘤细胞,但是还未能证明它能在癌症患者中也有同样的效能.现在免疫监视再次引起了大家的重视,因为一种新的     

genistein抑制人TNF-α诱导的猪内皮细胞对人单核细胞和自然杀伤细胞的黏附

研究了蛋白质酪氨酸磷酸化在hTNF-α诱导猪主动脉内皮细胞(PAEC)黏附分子E-选择素(E-selectin)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达以及在增强人外周血单核细胞(PBMo)和自然杀伤细胞(PBNK)黏附中的作用. 以选择性的蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)抑制剂genistein预处理PAEC, 剂量依赖性地抑制了hTNF-α增强的PAEC对PBMo和PBNK的黏附. 这种抑制作用发生在hTNF-α激活PAEC的早期, 并且具有可恢复性. PTKs活性测定表明genistein剂量也依赖性地抑制了hTNF-α对PAEC的PTKs的激活. 流式细胞术PAEC表型分析指出genistein抑制了hTNF-α诱导的E-selectin和VCAM-1的表达. 这些结果表明PTKs可以调节hTNF-α诱导的PAEC黏附分子E-selectin和VCAM-1的表达, 以及hTNF-α增强PBMo和PBNK的黏附, 而饮食来源的genistein可能会作为一种黏附拮抗剂在控制这种细胞介导的排斥应答中发挥作用.     

genistein抑制人TNF-诱导的猪内皮细胞对人单核细胞和自然杀伤细胞的黏附

研究了蛋白质酪氨酸磷酸化在hTNF-α诱导猪主动脉内皮细胞(PAEC)黏附分子E-选择素(E-selectin)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达以及在增强人外周血单核细胞(PBMo)和自然杀伤细胞(PBNK)黏附中的作用.以选择性的蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)抑制剂genistein预处理PAEC,剂量依赖性地抑制了hTNF-α增强的PAEC对PBMo和PBNK的黏附.这种抑制作用发生在hTNF-α活PAEC的早期,并且具有可恢复性.PTKs活性测定表明genistein剂量也依赖性地抑制了hTNF-α对PAEC的PTKs的激活.流式细胞术PAEC表型分析指出genistein抑制了hTNF-α诱导的E-selectin和VCAM-1的表达.这些结果表明PTKs可以调节hTNF-α诱导的PAEC黏附分子E-selectin和VCAM-1的表达,以及hTNF-α增强PBMo和PBNK的黏附,而饮食来源的genistein可能会作为一种黏附拮抗剂在控制这种细胞介导的排斥应答中发挥作用.     

中药及其活性成分对肿瘤相关调节性T细胞抑制作用研究

尽管只占外周CD4T淋巴细胞的10%,调节性T细胞(CD4~+ Foxp~(3+) regulatory T cells,Treg细胞)却是免疫系统不可缺少的重要组成部分,因为该群细胞对维持免疫系统内环境稳定及防止自身免疫反应至为关键。在肿瘤患者,Treg细胞大量积聚于肿瘤微环境中,强烈抑制机体对肿瘤的保护性免疫监视和对肿瘤的免疫反应,从而帮助肿瘤细胞发生免疫逃逸,促进肿瘤的发生和发展。目前的研究表明,中药可以通过减少Treg细胞的数量或比例、抑制Treg细胞的功能和相关细胞因子的产生以及转录因子的表达,从而抑制肿瘤的生长和转移。文章通过对有关文献的综述和分析,详细介绍了中药对肿瘤相关Treg细胞的作用及机制。     

猪自然杀伤T细胞研究进展

限制性自然杀伤T(invariant natural killer T,iNKT)细胞是一类同时表达NK与T细胞受体且具有NK细胞和T细胞两方面性质的独特淋巴细胞.与传统T细胞不同,iNKT细胞表达高度保守的T细胞受体(小鼠:TRAV11-TRAJ18、TRBV13、TRBV29或TRBV1;人:TRAV10-TRAJ...     

PI3K/Akt信号传递途径与CD3ε介导T淋巴细胞激活和凋亡的调控

利用Western 印迹免疫沉淀及激酶活性测定方法, 研究表达CD8a胞外区-跨膜区和CD3ε胞浆区的融合分子(CD8ε)的Jurkat T淋巴细胞激活与凋亡过程中磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB或Akt)表达及酶活性的变化. 结果表明, 在抗CD8单抗诱导的CD8ε Jurkat T淋巴细胞(TJK)激活与凋亡过程中, PI3K及Akt的表达均明显增加, Akt的激酶活性也增加. 而将CD8ε- ITAM中的一个酪氨酸(Y170)突变为苯丙氨酸(Y170F)并在CD8-细胞中表达(T1JK)后, 经CD8单抗刺激未发生细胞凋亡, 而且PI3K和Akt的表达水平及Akt的激酶活性也无明显变化, 表明PI3K及Akt参与了抗体诱导的T淋巴细胞激活与凋亡过程.     

联合转导人α1,3-半乳糖苷酶和α1,2-岩藻糖转移酶基因清除猪细胞表面异种抗原

猪细胞表面Galα1-3Galβ1-4GluNAc-R 结构(称为αGal 表位)是引起异种器官移植超急性排斥反应的主要原因, 被称为主要异种抗原, 由α1,3-半乳糖转移酶生成. α1,3-半乳糖苷酶特异性地水解αGal表位末端半乳糖, 可清除这种主要异种抗原; α1,2-岩藻糖转移酶与α1,3-半乳糖转移酶竞争底物的作用也可使Galα1,3-Gal 的生成量降低并阻止α1,3-半乳糖苷酶水解的产物重新生成Galα1,3-Gal, 也具有清除主要异种抗原的作用. 以猪胚胎成纤维细胞为靶细胞, 联合转导人α1,3-半乳糖苷酶和α1,2-岩藻糖转移酶基因, 获得的转基因细胞异种抗原清除率达84%, 转基因细胞染色体数目和形态正常, 为进一步获得低αGal 抗原的体细胞克隆猪奠定了基础.     

重组腺病毒AdCTLA4-FasL联合供者骨髓细胞输注促进混合嵌合体形成和小鼠皮肤移植耐受

在不对受体去髓处理的情况下, 用重组腺病毒AdCTLA4-FasL结合供者骨髓移植诱导混合嵌合体和同种皮肤移植耐受, 结果显示, 获得了持久宏嵌合体(macrochimerism)(140 d时, 供体细胞>20%). 同时, 这种嵌合体促进了稳定的供体特异性耐受, BALB/c小鼠的皮肤移植物在B6受体小鼠中长期存活(平均存活时间(the mean survival time, MST)大于200 d), 而来源于ICR小鼠的第三者皮肤移植物被该嵌合体小鼠正常排斥. 用该方法处理的B6小鼠在接受皮肤移植14 d后, 辅助性T淋巴细胞前体(HTLp)和细胞毒T淋巴细胞前体(CTLp)的频数降低到很低的水平, 表明AdCTLA4-FasL能够迅速促进全面的外周耐受, 从而有利于供体骨髓细胞植入. 接受皮肤移植140 d后, 供体皮肤仅在形成长期嵌合体的受体小鼠中继续存活, 这些小鼠体内供体特异性的HTLp和CTLp的频数减少, 提示长期的皮肤移植物耐受与稳定的混合嵌合体有关, 中枢性T细胞删除可能是耐受维持的主要机制.     

TNF-α 诱导血管内皮细胞的衰老

TNF-α 是 极为重要的促炎性细胞因子, 在调节细胞免疫反应中起着多种生理和病理作用. TNF-α 能激活血管内皮细胞, 继而表达多种细胞因子和黏附分子引发一系列的炎性白细胞浸润和炎症反应. 研究发现TNF-α 炎性刺激除了能引起内皮细胞死亡外, 还能诱导内皮细胞的衰老. TNF-α 处理的血管内皮细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染色反应显示阳性, 细胞周期停滞在G0~G1期; 内皮细胞中线粒体膜电位早期上升, 衰老时则降低, 表征早期细胞线粒体功能亢进, 而后期功能衰退; 活性氧水平早期有上升和下降的振荡, 诱导衰老后有所降低. 结果表明线粒体的功能变化与TNF-α 诱导的内皮细胞衰老有关.     

同源于hMIP-1a 的vMIPa 对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4+白细胞膜上的趋化因子受体为共受体, 与此共受体结合的趋化因子类似物可阻止HIV进入靶细胞. 实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1a (MIP-1a)同源的人疱疹病毒8 K6基因编码产物vMIPa 是否具有结合人趋化因子受体的功能. 首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPa与人趋化因子的结构异同, 用PCR扩增出K6片段, 克隆于哺乳类细胞表达载体, 转染于NIH3T3细胞, 得到条件培养液. 然后将K6基因在大肠杆菌中表达, 得表达产物vMIPa. 结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPa单一分子量的mRNA, 此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPa可与人趋化因子125I-hMIP-1a竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体, 而且此条件培养液及vMIPa不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应. 研究证实K6编码产物vMIPa与CCR5结合但不引起细胞黏附反应, 即封闭HIV的CCR5共受体, 提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性.