HPV 58型E7蛋白特异结合多肽的筛选及分析

 利用M13噬菌体展示技术筛选HPV 58型E7蛋白特异性结合12肽,对这些多肽的序列比对分析得出其共有序列,同时通过BLASTP序列对比分析获得能与E7结合的内源蛋白.利用GST-E7融合表达蛋白为正筛靶分子,GST蛋白为负筛靶分子进行4轮的正负亲和筛选,经过ELISA活性鉴定获得71株阳性克隆,通过DNA测序和序列分析,得到2个能与E7蛋白发生特异性结合的共有序列NHXXANPQQXPQ和TMGFTAPRF-PHY.通过BLASTP分析所有71个多肽在体内的同源蛋白,它们能为对E7蛋白的致癌机理研究提供方向.     

表达肿瘤抗原HPV-58 E7的HLA-A*0201阳性宫颈癌细胞模型的构建和鉴定

为建立内源性表达58型人乳头瘤病毒(Huamn papillomavirus type 58,HPV-58)重要癌抗原E7蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型.以HPV-58全基因组为模板,采用PCR法扩增E7蛋白的编码基因,构建真核表达载体pEGFP-N2-HPV58E7;转化大肠杆菌DH5α,通过DNA测序鉴定质粒载体;经除内毒素纯化后,将大量制备的重组质粒瞬时转染293T细胞,采用RT-PCR和细胞免疫荧光方法研究重组质粒在人源细胞中的表达情况;最后,选择HPV检出阴性的HLA-A*0201阳性人宫颈癌C33A细胞株为宿主细胞,采用脂质体转染、G418抗性加压筛选和细胞克隆化培养技术,建立能够稳定表达HPV-58 E7的恒定转染细胞株.采用RT-PCR、Western-blot和细胞增殖测定等方法从转录、翻译和表型等3个层次对所建细胞株进行鉴定研究.研究结果显示:克隆制备了HPV-58 E7蛋白的编码基因;构建获得了能够在人源细胞中表达HPV58E7-EGFP融合蛋白的真核表达质粒;并成功建立了能够稳定表达HPV-58 E7的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型;核酸和蛋白水平的鉴定结果表明所建模型细胞能够表达HPV-58 E7癌抗原,宿主细胞本身表达的Ⅰ类组织相容性抗原HLA-A*0201有望通过内源性抗原加工途径将E7抗原的细胞毒性T细胞(Cytotoxic lyphocyte,CTL)表位提呈到细胞表面;另外,细胞增殖试验结果亦表明该细胞模型体现出E7蛋白显著的诱导细胞增殖的生物学特征.总之,能够稳定表达HPV-58 E7癌蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型的建立为后续即将展开的以HPV-58 E7为靶标的宫颈癌治疗性疫苗和药物的寻找和研究奠定基础.     

噬菌体展示技术筛选布鲁氏菌OMP25特异性结合肽

利用噬菌体展示技术和ELISA筛选与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25结合的七肽分子.将纯化的OMP25-32a包被于聚乙烯板上,对随机噬菌体七肽库进行4轮筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA鉴定噬菌体克隆对OMP25-32a的亲和力和特异性.并将阳性噬菌体克隆扩增、测序、获得多肽氨基酸序列,生物信息分析筛选出特异的环形七肽分子.结果从噬菌体七肽库中筛选出42个噬菌体阳性克隆,测序翻译得到对应的42个环形七肽分子;ELISA结果表明,42个噬菌体中9#、11#、35#、38#和41#与融合蛋白OMP25-32a具有较强的亲和性;生物信息学分析42个环形七肽分子中11#环形七肽与锌指蛋白ZNF446有高度同源性.筛选获得了与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25相互作用的环形七肽分子LT-7C,为进一步研究抗布鲁氏菌病的药物治疗提供科学依据.     

利用蛋白质微阵列筛选抗胸腺瘤优势抗原表位

通过设计多个针对Titin蛋白胞外区多肽序列,用蛋白质微阵列方法筛选抗Titin抗体识别的优势抗原表位,并用ELISA法进行验证.结果显示,在84例MG血清中,51例抗多肽自身抗体阳性,阳性率60.71%.经蛋白质微阵列筛选和ELISA法验证,发现在设计的9条多肽抗原中,P5、P6和P9是优势识别抗原线性表位;进一步发现自身抗体识别的P5与P9多肽表位存在交叉性,并且均能被多肽抗原阻断.结果表明,用蛋白质微阵列方法可有效筛选针对Titin自身抗体识别的优势抗原线性表位.     

细粒棘球绦虫AgB1抗原表位的生物信息学预测

 以细粒棘球绦虫AgB1基因序列为基础,采用PredictProtein软件预测其编码蛋白的二级结构;应用在线预测软件Bcepred、Abcpred、IEDB及SYFPEITHI等对细粒棘球绦虫AgB1的B细胞表位和T细胞表位进行预测。结果提示,AgB1抗原蛋白存在可以构成抗原表位的区域,经软件分析,分值高的B细胞表位区域:2~9、15~20、22~35和41~52氨基酸序列;T细胞表位区域:3~12、26~33、34~44和52~61氨基酸序列。研究运用生物信息学确定AgB1抗原的4个B细胞优势表位和4个T细胞优势表位,对进一步研究AgB1的抗原性和研发更有价值的免疫诊断方法具有重要意义。     

亲环素A抗原表位在三维结构中的初步定位

以抗人亲环素A单克隆抗体D4作捕获抗体，用噬菌体展示库鉴定出亲环素A模拟抗原表位的氨基酸序列为WSLQSFL，在亲环素A的一级结构中没有相同的序列，提示亲环素A抗原表位为构象型的，亲环素A的三维空间结构已测定，利用RasMol等蛋白质三维结构观察软件，可以初步确定亲环素A的抗原表位的时间位置，此抗原表位与环孢素的结合位点有重叠。     

抗A5型口蹄疫病毒重组多肽疫苗的研究

根据A型口蹄疫病毒（FMDV）的VP1基因序列及国际上公认的抗病毒中和表位,并结合对口蹄疫病毒的研究成果。设计了A型FMDV的重组多肽疫苗．分别选择VP1上21～40位和137～160位氨基酸对应的基因序列为表位基因,组成137～160—21～40-137～160的串连结构,并以大肠杆菌β-半乳糖苷酶为大分子载体,构建重组质粒pLM99,在大肠杆菌中表达得到高含量的融和蛋白．体外免疫原性检测表明,所表达的融和蛋白与标准A型阳性血清有特异性抗原／抗体反应,即说明该融和蛋白具有免疫反应性．免疫豚鼠的实验结果表明,融合蛋白能在豚鼠体内诱导中和抗体,并使70％的豚鼠能抵抗病毒的攻击．     

Cε3-Cε4结合肽筛选及鉴定

为了获得免疫球蛋白E(IgE)特异性结合肽,采用固相筛选法,以Cε3-Cε4为靶蛋白,利用噬菌体随机多肽展示技术进行筛选,4轮筛选后,经ELISA鉴定获得19个阳性单克隆噬菌体,阳性率达38％,测序并翻译后共获得11个结合肽.竞争抑制性实验证明P7,P13,P20与Cε3-Cε4蛋白的结合能力较强,细胞水平分析表明:结合肽P7,P20可阻止IgE与其受体结合.本研究将为进一步探索IgE结合肽生物学功能奠定基础,并为设计治疗变态反应性疾病的小分子药物提供参考.     

马铃薯钙调素表位的微机多参数预测

据文献报道［１－３］,分析蛋白氨基酸序列的某些参数,如 Ｈｏｐｐ　＆ Ｗｏｏｄｓ　亲水性和Ｗｅｌｌｉｎｇ抗原性,可达到预测蛋白抗原分子表位的目的。本研究借助微机,对马铃薯钙调素分子表位进行了预测和分析,结果表明,该种钙调素分子存在７个表位,其中至少有３个表位可能严生相应抗体。鉴于钙调素分子一级结构具有高度保守性,以上预测结果对研制各种植物钙调素单克隆抗体均有较大的参考价值。     

旋毛虫21 KDa排泄分泌抗原二级结构及T细胞和B细胞表位预测

应用SYFPEITHI和Propred程序和多种预测方案对旋毛虫21 KDa排泄分泌抗原的T细胞表位、二级结构、疏水性、柔韧性、表面可能性、两性区以及B细胞表位进行预测.旋毛虫21 KDa排泄分泌抗原存在2个较强的T细胞表位区,分别为第9~23位和第135~150位氨基酸位点;潜在的B细胞表位存在于从第28个氨基酸残基开始的广大区域内.预测结果为旋毛虫病诊断和新型疫苗研制提供候选抗原.     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

结核分枝杆菌H37Ra FadD3基因克隆与表达研究

为探索FadD3在结核分枝杆菌胆固醇分解代谢中的作用,从结核分枝杆菌H37Ra的全基因组中克隆了FadD3基因,并在大肠杆菌BL21中表达.根据NCBI公布的结核分枝杆菌全基因组序列设计一对引物,PCR扩增FadD3基因.PCR扩增产物与克隆载体pGEM3Zf(+)进行拼接,得到重组基因FadD3-pGEM3Zf(+),再转化到大肠杆菌DH5ɑ得到克隆.PCR检测阳性克隆,再与表达载体pYUB28b拼接,得到重组质粒FadD3-pYUB28b.阳性重组质粒亚克隆到大肠杆菌BL21宿主菌进行自体诱导表达.经过表型筛选及鉴定分析,已成功构建了重组表达质粒FadD3-pYUB28b.SDS-PAGE和Western blotting证实,重组基因FadD3-pYUB28b在大肠杆菌BL21中有表达产物.实验结果表明,以pYUB28b为表达载体,FadD3重组基因在大肠杆菌表达体系于温度分别为18,28 ℃有包涵体形式的表达蛋白,在37 ℃无表达产物.     

高低危型HPV E7的分析以及58型E7结构与结合位点预测

 对18种HPV E7蛋白进行生物信息学分析,同时对HPV58 E7进行结构以及可结合位点的预测.从NCBI数据库中获取蛋白序列,通过ExPASy Protparam进行生物信息分析,Clustal W进行多序列比对,MEGA软件构建进化树,利用Zhang lab QUARK以及Q-SiteFinder能量依赖的检测对HPV58 E7进行结构预测与结合位点预测.得到了E7生物信息,多序列比对数据,构建成进化树,获得HPV58 E7蛋白结构,并且找到pRb与E7结合的三维位点.不同类型HPV E7蛋白存在进化差异,得到的HPV58型结构以及与pRb的可以结合位点,为抑制HPV58 E7蛋白功能的相关实验提供了理论依据.     

人ZP3B-细胞表位嵌合肽DNA的设计和合成

目的：设计和合成适合在昆虫细胞中表达的一个人ＺＰ３ Ｂ细胞表位的ＤＮＡ序列。方法：根据国外的研究基础，设计由人ＺＰ３的Ｂ细胞表位肽段和外源Ｔｈ细胞表位肽段串联而成的４５肽嵌合肽序列，并根据昆虫细胞对密码子的偏爱性设计出该嵌合肽的ＤＮＡ序列。然后人工合成该嵌合肽的ＤＮＡ链，并克隆到ＰＵＣ１８载体上。结果：通过酶切分析和测序证明，合成的ＤＮＡ与所设计的嵌合肽ＤＮＡ序列一致。结论：按设计合成了人ＺＰ３的     

Class I cross-restricted T cells reveal low responder allele due to processing of viral antigen

Cytotoxic T lymphocytes (CTL) recognize protein antigens which have been processed by the target cell and then presented in association with the relevant class I molecule of the major histocompatibility complex (MHC). Short synthetic peptides, which are able to associate directly with target cells, may substitute for these processed fragments in stimulating antigen-specific CTL responses. Using this approach, a dominant HLA-A2-restricted epitope has previously been mapped to residues 58-68 of influenza A virus matrix protein. Here we report HLA-A2-restricted CTL which are also able to recognize this short synthetic peptide in association with HLA-Aw69, but which fail to recognize HLA-Aw69 expressing cells infected with influenza A virus. Furthermore, individuals possessing HLA-Aw69 who respond to influenza A virus, do not respond to M58-68. These results imply that the low response to this epitope on infection of HLA-Aw69 individuals with influenza A is due to failure of the naturally processed product of matrix protein to associate with Aw69.     

转基因小黑杨对土壤微生物群落结构的影响

为评价转基因林木环境释放可能引起的生态风险,以及转基因林木在生产应用中的可行性和可靠性,以实验室种植的转Bt-蜘蛛神经毒肽重组基因的小黑杨为材料,对转基因与非转基因植株根际(通常为几毫米至几厘米)土壤细菌、放线菌、真菌数量和基因水平转移情况进行检测,结果表明:转基因小黑杨种植一段时间后其根系附近的微生物数量略高于非转基因小黑杨。利用卡那霉素选择培养基分离根系周围细菌菌落发现转基因植株周围的土样细菌中,Kan^R抗性细菌菌落数占总细菌菌落的比例在11.58%～13.00%之间,而非转基因植株根际周围和空白土壤细菌菌落数则在5.73%～6.40%之间,表明转基因小黑杨根系对土壤细菌的抗生素抗性产生一定的影响。利用转基因植株的目的基因和抗性基因设计引物,以土壤中细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,转基因植株种植7个月后,根际土壤细菌菌落中含有抗性基因的菌落数量明显增加。虽然在种植1个月的转基因植株根际土壤土样细菌中未检出目的基因,但在种植7个月后的土样中检验到了很少的目的基因阳性细菌,阳性细菌菌落比例为2%～5%,检测结果表明可能有极少数Bt-蜘蛛神经毒肽重组基因发生了水平转移。     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.