流式细胞术优化MDCK细胞基因转染效率的研究

为探究脂质体介导的MDCK细胞基因转染效率,并获得最佳的优化方案,本研究选取不同配比的质粒和脂质体浓度,将p-EGFP-C1质粒转入MDCK细胞。转染后36h,利用台盼蓝染色法检测细胞活率,流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率,获得优化的转染条件。结果发现,转染后MDCK细胞,实验组细胞活力与阴性对照组差异不显著(P>0.05)。当质粒(μg)∶脂质体(μL)浓度配比为0.5∶1.0、0.5∶1.25、0.5∶1.5时,转染率达到了较高水平,分别为(23.4±3.4)%、(24.5±4.5)%、(25.2±3.7)%,从经济因素考虑,脂质体介导的MDCK细胞基因转染质粒(μg)与脂质体(μL)的最佳配比浓度为0.5∶1.0。这为MDCK细胞用于基因转染提供了一定的理论基础。     

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

Survivin-siRNA真核重组质粒的构建及对前列腺癌DU145细胞增殖抑制作用

目的应用RNA干扰技术(RNAi),构建针对凋亡抑制因子survivin的siRNA,并检测其对DU145细胞增殖抑制的影响.方法构建重组质粒shRNA-sur1和shRNA-sur2并分别转染DU145细胞株,通过MTT法和流式细胞术观察其对细胞的增殖抑制作用及凋亡的影响.结果成功构建针对survivin干扰的两种真核表达质粒,转染72 h后,两个实验组细胞的生长速度分别是脂质体组的(37.2%±5.8%)(n=3)和(43.5%±7.2%)(n=3).流式细胞术发现:实验组细胞的G1期细胞比例明显高于对照组,而G2期和S期细胞比例减少,细胞出现凋亡,与脂质体组比较,两实验组细胞的凋亡率分别为(21.70%±6.45%),(14.835±5.65%).结论成功构建针对survivin siRNA的真核重组质粒,两种质粒体外均可抑制DU145增殖并诱导其凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉默提供良好的基础.     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达与鉴定

SLC38基因家族编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白3(SNAT3)是System N中的一员.它在大脑谷氨酸-谷氨酰胺循环以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程中发挥着重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达与定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SNAT3的N末端连接,通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到pBK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒.用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞(HEK293T cells),利用激光扫描共聚焦显微镜和Western blot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位.结果表明,EGFPSNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上.EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

草鱼生长激素基因在COS7细胞中转染表达的研究

应用RT-PCR技术克隆草鱼生长激素(gcGH)的cDNA,将此cDNA定向插入真核表达载体VR1020中,构建成重组真核表达质粒VgcGH.利用脂质体法使质粒VgcGH转染哺乳动物细胞COS7,对转染后的COS7细胞进行RT-PCR、ELISA和免疫荧光检测,分别在转录和翻译水平证实gcGH基因在COS7细胞中得到了持续和正确的转染表达.     

PEI介导pCEP4/EGFP瞬时转染293-F细胞条件优化

为构建真核表达载体pCEP4/EGFP,PEI介导瞬时转染293-F细胞,观察转染效率,优化转染条件.通过NotI和Hind III酶切位点将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)插入真核表达载体p CEP4中,并转化Trans5α感受态细胞,氨苄青霉素筛选培养,挑取阳性克隆扩增后提取质粒,酶切鉴定正确后,PEI介导转染293-F细胞,流式细胞仪检测转染效率.实验结果表明,成功构建了真核表达载体pCEP4/EGFP,当N/P(PEI/DNA)为25,悬浮培养模式下转染293-F细胞,48 h转染效率为77.57%,重组载体p CEP4瞬时转染293-F细胞,可获得理想转染效果.     

脂质体转染人肝星状细胞和肝细胞条件优化

利用Lipofectamine 2000(Lipo)介导LacZ及EGFP基因转染人肝星状细胞系LX-2和人肝细胞系Chang Liver,探讨Lipo用量、质粒用量、转染时间、细胞初始接种密度及不同启动子驱动对转染效率的影响.结果显示,两种细胞均能得到高效转染,Chang Liver细胞转染效率(80%)高于LX-2细胞(60%).Lipo用量为每孔2μL,转染后6 h换液,LX-2细胞应用质粒DNA为每孔0.45μg,Chang Liver细胞应用质粒DNA为每孔0.30~0.45μg,此时转染效率最高.巨细胞病毒(CMV)启动子驱动LacZ转染效率与CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染效率无显著差异;细胞初始接种密度对转染效率无显著影响.     

高效转染HepG2细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用

为构建含绿色荧光蛋白(EGFP)和人胰岛素原基因的逆转录病毒表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达,将IRES-EGFP片段克隆到含调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体(pLXSN-GI-Ins)中,构建得到表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP.经脂质体介导转染HepG2细胞后,各孔分别加入含有30.0 mmol/L葡萄糖的培养液继续培养24 h,在荧光显微镜下观察EGFP基因的表达,检测细胞上清液中的胰岛素值.数据显示,成功构建逆转录病毒表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP.转染HepG2细胞后48 h,表达EGFP基因的细胞数目占总细胞数目的比值为(38.0±5.0)%.结果表明,构建了含EGFP和调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体,并且能够在HepG2细胞中成功表达.     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

老年人生活空间移动性影响要素研究进展

 老年人生活空间移动性是老年人在日常生活中能动生活状态的重要表征。在梳理老年人生活空间移动性相关概念、测度方法基础上,分析了物质环境要素和非物质环境要素对老年人生活空间移动性的影响;提炼出有效支持老年人生活空间移动性的中观环境规划、微观环境设计和政策文化扶助层面的策略;指出了老年人生活空间移动性的研究建议和发展方向。     

十二烷基苯硝化选择性的测定

利用对位异构体的对称性由核磁共振氢谱测定了工业十二烷基苯在硝硫混酸中的硝化选择性，发现一硝化产物中对位异构体的比例为７５％￣８０％。以月桂酸和苯为原料，经氯化、酰化和还原合成了正十二烷基苯。在同样条件下研究了正十二烷基苯的硝化，由核磁共振氢谱和气相色谱分析，发现一硝化产物中对位异构体的比例仅为６０％。根据空间位阻效应，对结果进行了讨论，并与甲苯，乙苯，异丙苯等短链烷基苯的硝化结果进行了比较。     

YBCO掺杂效应研究

介绍了YBCO掺杂的基础知识,总结了YBCO各个位置采用典型元素掺杂而导致的超导电性和结构的变化,阐述了掺杂对YBCO的重要影响,并简介了当前YBCO掺杂效应研究中的几个热点问题.     

新疆哈密瓜细菌性斑点病病原的鉴定

2000年6-8月从新疆北部主要哈密瓜产区采集分离纯化11个哈密瓜细菌性斑点病菌株,经致病性测定和细菌形态学、培养性状、生理生化特性及G Cmol%含量测定,确定采自叶片病斑上的9个供试菌为丁香假单胞菌黄瓜致病变种（Pseuodomonas syringae pv.lachrymans),而侵染果实的病原菌可能还包括果斑菌（Acidororax.arenae subsp citrulli)。     

高频机组基础振动检测分析

为了找出诱发高频机组基础不良振动的原因，从基础计算模型方面对基础激励与响应进行了分析，以两个高频机组基础为动测实例，经模态分析得出钢筋混凝土构架式基础竖向1阶振动与电机产生共振；应用功率谱法对动力机组及基础平台进行动测，得出平台异常响应频率66Hz为水泵工作频率，调整机器的工作频率可避开不良振源影响，达到明显的减振效果。由此而知，动力机器基础出现不良振动时，不可盲目改变结构的动力特性，应在机器不同工况比如：停机、起机及正常转速下，对机器及基础进行动测并对振动信号进行比较分析，以制定出行之有效的减振方法。     

当代大学生幸福感缺失现象探析

幸福是人类追求的终极目标,也是一个永恒的伦理话题,人类对幸福的自觉追求是推动社会历史进步的动力之一.中国当前社会正处在空前的转型时期,当代大学生幸福感的缺失在相当程度上存在,并呈现出上升趋势.究竟是什么原因导致此现象的出现?作者从对幸福和幸福感的考证入手,具体分析了当代大学生幸福感缺失的原因,并在此基础之上提出了相应的解决之策.     

整数幂的和计算中的一些规律

给出整数幂的和的另一种计算公式的方法.     

行政机关违法设定许可的法律责任探析

对于行政许可违法的法律责任问题，人们往往是从行政许可实施违法的角度进行研究，而对于设定违法及其责任追究的探讨却相对薄弱。然而。行政许可设定一旦违法，其对相对人和社会公共利益的损害将会更大，因此，对许可设定的违法及其责任问题进行研究，以避免违法行政行为的发生，促进政府依法行政，不仅必要而且是非常有意义的。