组氨酸标签木聚糖酶的构建表达和酶特性鉴定

通过改变终止密码子位点,在一个耐热木聚糖酶突变株DSB的C末端添加了6聚组氨酸标签(His-tag),并完成了表达和酶特性鉴定.通过PCR将嗜热真菌DSM 10635来源的木聚糖酶突变体基因dsb的终止密码子序列定点突变为谷氨酸密码子序列,连接到表达载体pET-22b(+),转化Escherichia coli.BL21(DE3),诱导表达的耐热木聚糖酶DSB在C端含有6×His-tag.表达产物经硫酸铵分级沉淀和Ni Sepharose层析纯化,获得了电泳纯重组酶DSB.结果表明:添加组氨酸标签的酶与原始酶相比,酶学特性无变化.SDS-PAGE电泳结果显示该酶分子量约为23 kDa,重组酶最适pH为6.5,最适温度为75℃,在pH 5¹0具有良好的稳定性,在pH 6.5,70℃条件下处理30min相对酶活力仍保留80%以上.     

地芽孢杆菌(Geobacillus)YHL的全基因组测序及序列分析

该文采用Illumina 高通量测序技术对地芽孢杆菌(Geobacillus sp. YHL)进行全基因组测序,使用Velet软件进行组装,利用Glimmer软件对菌株进行基因预测,得到的蛋白质通过与COG、KEGG等数据库进行比对来获得相应的注释信息.利用多种绘图工具对注释信息进行汇总及分析,获得了COG、KEGG等多种基础注释信息,对这些信息进行挖掘分析,研究结果发现:该菌株具有多种编码酶基因,包括糖苷水解酶、葡糖苷酶、木聚糖酶、淀粉酶、新普鲁兰酶、支链淀粉酶和脂肪酶,是一种嗜热的多酶编码菌,有一定的应用潜力.重点关注了在基因组中编码热应激蛋白基因,这些基因信息最终可以提供关于细菌的热适应机制的初步解释.     

纤维微菌XM-8木聚糖酶基因克隆及酶学性质

【目的】为获得可应用于木聚糖水解的酶资源,希望通过筛选分离得到能够水解木聚糖的木聚糖酶产生菌,克隆表达木聚糖酶基因并研究其酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解木聚糖的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定。扩增其木聚糖酶基因,以pET22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为纤维微菌。通过PCR成功克隆到该菌的木聚糖酶基因(xyn-8a),并构建共表达质粒pET22b-xyn-8a,实现木聚糖酶Xyn-8a的活性表达。酶学性质研究表明Xyn-8a最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,只对木聚糖底物有活性;HPLC分析其水解产物以木二糖为主,还有少量的木糖和木三糖。【结论】XYN-8A在pH值为6的条件下具有较高活力,且可以催化水解反应,在生产低聚木糖方面具有一定的应用价值。     

黑曲霉木聚糖酶基因xynB的克隆及在酿酒酵母中的表达

从黑曲霉(Aspergillus niger)克隆木聚糖酶基因xynB,利用重叠延伸PCR法去除其中的内含子.将该基因与质粒pYES2连接,构建真核表达载体,用醋酸锂化转法导人酿酒酵母(Sacharom yces cerevisiae)INVSC1菌株表达.利用α信号肽替换基因原信号肽,以考察信号肽对表达蛋白分泌的影响.结果获得2株重组菌株,分别为xynB连接原信号肽的pYES2-xynB菌株和xynB连接α信号肽的pYES2-xynB-α菌株.木聚糖酶B成功表达,SDS-PAGE检测到约24kDa目的蛋白质条带.木聚糖酶B最适催化温度为50℃,最适催化pH值为5.0,Mn2+对酶活具有强烈的抑制作用.将α信号肽取代原信号肽使酶活达到最高的诱导时间由72h缩短为48h,但是置换信号肽使最高酶活由7.59U降低为3.97U.     

二硫键影响GH11木聚糖酶稳定性研究进展

低聚木糖具有改善肠道微生态的益生作用,在降血糖、降血压、防止便秘等方面表现出良好的保健效果。近年来,利用生物酶技术制备功能性低聚木糖的相关研究受到广泛关注。糖苷水解酶(glycoside hydrolase, GH)11家族木聚糖酶具有底物特异性强和催化效率高的特点,在低聚木糖生产应用中表现出显著优势；然而,大多数天然GH11木聚糖酶存在稳定性较差的问题,无法满足工业生产中高温、酸、碱等极端条件的要求。利用酶工程技术对天然木聚糖酶进行分子改造,以适应高温、酸、碱等生产条件,使底物特异性强、催化效率高的酶相对稳定地发挥作用,对于制备功能性低聚木糖的工业生产具有重要的实际意义。根据GH11木聚糖酶的分子结构及其特点,通过比较其分子内相互作用力对酶热稳定性的影响,发现二硫键在改善酶的稳定性方面具有十分显著的优势。基于对GH11木聚糖酶结构的分析,总结了引入二硫键的常规策略,比较了酶在不同区域引入不同数量二硫键对GH11木聚糖酶稳定性的改善效果,对引入二硫键后酶稳定性显著变化的几个区域进行定位,并指出多个二硫键对改善酶稳定性的作用方式,希望为提高酶稳定性的酶分子改造研究提供基础数据,为拓宽GH11木聚糖酶工业应用范围提供科学参考。     

匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶培养基优化研究

利用响应面法对匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶的培养基进行优化研究.采用单因素实验,得到最佳的碳源、氮源、无机盐.采用Plackett-Burman对影响匍枝根霉产木聚糖酶发酵的相关因素进行评价,确定有显著效应的3个因素.采用最陡爬坡实验确定接近响应值区域显著因素的浓度,利用3因素3水平的Box-Behnken实验进行培养基优化.结果表明,培养基组成:3.9%麦麸玉米芯粉混合碳源,0.35%(NH4)2SO4,0.2%KH2PO4,0.2%MgSO4·7H2O,0.4%CaCl2,0.06%吐温-80,1%微量元素液,装液量为100mL,pH自然,接种量为10%,在30℃,180r/min条件下培养,其木聚糖酶酶活达到最高为101.697U/mL,比优化前木聚糖酶酶活提高了3.5倍.     

嗜碱芽孢杆菌耐热耐碱内切木聚糖酶基因的密码子优化及在毕赤酵母中的表达

【目的】研究极端耐热耐碱的木聚糖酶,使其能够满足造纸行业中碱性高温的苛刻环境。【方法】将一种来源于嗜碱芽孢杆菌S7的耐热耐碱内切木聚糖酶基因(xyn10A)密码子进行优化,基因合成后克隆至pHBM905BDM载体上,并转化毕赤酵母GS115菌株。【结果】木聚糖酶基因(xyn10A)优化后与原始序列比对相似性为76.70%。基因合成后克隆到pHBM905BDM载体上,并成功转化毕赤酵母GS115菌株。通过交联木聚糖底物平板水解圈法初筛及摇瓶复筛得到一株产酶量较高的菌株,且其在摇瓶发酵第10天达到最高酶活力,为495U/mL。另外,糖基化分析表明该酶在毕赤酵母中表达时被糖基化修饰。【结论】密码子优化后的极端耐热耐碱木聚糖酶基因在毕赤酵母中成功表达。     

嗜热菌Thermaerobacter subterraneus DSM13965磷酸三酯酶的原核表达、 ]纯化及性质表征

将来源于嗜热菌Thermaerobacter subterraneus DSM13965的磷酸三酯酶基因在大肠杆菌BL21中高效表达, 并采用超声、 热失活和组氨酸标签
镍柱对产物进行分离纯化, 通过SDS PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定. 结果表明: 该重组酶以二聚体的寡聚体形式存在; 其最适温度为70 ℃, 最适pH=10.0, 具有良好的热稳定性.     

黑曲霉S13所产木聚糖酶的性质及应用研究

木聚糖酶作用的最适温度为50℃,最适pH为4～6,在pH为1～12酶活性稳定.木聚糖酶的热稳定性差,60℃保温1h剩余酶活为1.65%.木聚糖酶受大多数金属离子的抑制,其中Cu2+的抑制作用最大.木聚糖酶应用于饲料发酵和纸浆漂白过程中,可以有效地降低饲料中的粗纤维含量和改善纸张的性能并减小污染.     

木聚糖酶的研究进展

木聚糖是半纤维素的一种重要组成成分,广泛存在于各种植物资源中;木聚糖酶是降解木聚糖为木寡糖和木糖的水解酶.产木聚糖酶微生物主要有细菌、放线菌,真菌等.木聚糖酶相对分子质量一般在8-145ku,具有双功能性和多样性.木聚糖酶的功能结构域主要有催化结构域和纤维素结合结构域,其酶活受金属离子、糖苷键等的影响.目前,已有上百种木聚糖酶基因被克隆表达.木聚糖酶的应用极其广泛,可用于造纸、饲料、食品、医药等行业.