从梨花迁粉蝶中所得微孢子虫的系统进化分析

从中国云南省野外采集的梨花迁粉蝶(Catopsilia pyranthe)中分离得到一株疑似微孢子虫,对该分离株的核糖体SSUrRNA(Small subunit ribosomal RNA)和α-tubulin 基因进行克隆测序。通过序列分析及系统进化树构建,结果发现该分离株属于 Nosema属的一种微孢子虫,命名为 Nosema sp.CP。通过对SSUrRNA系统进化分析发现,Nosema sp.CP与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、斜纹夜蛾微孢子虫(Nosema spodopterae)的亲缘关系相对于菜粉蝶微孢子虫Nosema sp.MPr更加接近。通过对α-tubulin 基因的系统进化分析,结果表明 Nosema sp.CP与 N.bombycis聚在一支上,进一步证实了它们的紧密关系。因此,本研究首次在粉蝶科(Pieridae)的梨花迁粉蝶中分离得到的 Nosema属微孢子虫是与家蚕微孢子虫非常近源的一类微孢子虫,并暗示了粉蝶科昆虫感染的微孢子虫具有潜在多样性。
     

重庆地区家蚕微孢子虫遗传多态性分析

为探讨家蚕微孢子虫种内的遗传多样性,对本实验室保存的一株家蚕微孢子虫的SSUrDNA,rDNA—ITS,rDNA—IGS,Sec61β5’上游序列（Nb—IGS1）和Hsp70 5’上游序列（Nb—IGS2）进行了PCR扩增和序列测定．多重序列比对发现它们都存在着不同程度的多态性．其中rDNA—ITS和rDNA—IGS遗传多样性最为明显,序列中存在较大的差异区域,包括多碱基的插入或缺失、单碱基的转换和颠换;而对基因上游的调控序列分析发现,Nb—IGS1和Nb—IGS2序列中存在着少量的变异位点．结合GenBank中Nosema属微孢子虫的同源序列,分别构建rDNA-ITS和rDNA-IGS系统树,结果表明重庆地区家蚕微孢子虫遗传分化比较明显．研究表明家蚕微孢子虫种内存在遗传多样性．     

柞蚕微孢子虫基因组LTR反转座子鉴定与进化分析

【目的】鉴定柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组中LTR反转座子的种类、数量和遗传关系。【方法】从GenBank数据库下载柞蚕微孢子虫基因组序列,采用MGEScan软件筛选潜在重复元件,通过NCBI-BLAST与不同物种的逆转酶进行比对,含有逆转录酶结构域的序列认定为LTR反转座子,并探讨它们的结构特征、所属类型和基因组分布特点。【结果】从柞蚕微孢子虫基因组中共发现6个LTR反转座子家族即Nar1,Nar2,Nar3,Nar4,Nar5和Nar6,长度在3～4kb之间;大部分家族有相似的LTR末端核苷酸,但靶位点重复和拷贝数存在差异;逆转录酶结构域系统进化树显示6个LTR反转座子家族均属于Ty3/Gypsy类型,且与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)LTR反转座子形成姊妹分支;Nar2和Nar4家族在基因组上成串排列,具有相似的分布特征。【结论】柞蚕微孢子虫基因组中存在Ty3/Gypsy类型的LTR反转座元件,进化地位与家蚕微孢子虫最为接近;LTR反转座子家族重复元件在基因组上成串排列,可能是柞蚕微孢子虫基因组扩张的潜在因素之一。     

家蚕微孢子虫侵染家蚕胚胎细胞与草地贪夜蛾细胞的病变比较

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是引起家蚕微粒子病的病原,是一种无线粒体的专性细胞内寄生的原虫.将N.bombycis经KOH处理后,接种于家蚕胚胎细胞(BmE细胞)和草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21).用倒置显微镜对微孢子虫在宿主细胞中感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察,比较两种细胞接种N.bombycis后所出现的形态学变化.接种后第12天起,两种细胞内均充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动.在感染晚期,Sf21中有许多孢子从细胞中逸出,留下许多空泡,细胞还保持一定的完整性,而家蚕胚胎细胞则在感染后期完全崩解.这种差异可能是Sf21作为一种非原宿主细胞,对N.bombycis的感染有一定耐受性有关.     

斜纹夜蛾微孢子虫在昆虫细胞系的体外培养

以受斜纹夜蛾微孢子虫(Nosema sp.)感染的斜纹夜蛾幼虫血淋巴感染草地贪夜蛾传代细胞系,建立了感染斜纹夜蛾微孢子虫的体外传代细胞.以这种体外细胞培养试验证明,斜纹夜蛾微孢子虫不能在37℃下发育,最适发育温度为25℃.用光学显微镜及电子显微镜的研究证明,斜纹夜蛾微孢子虫整个生活周期都以一对双核存在,母孢子以二分裂形成两个孢子母细胞;孢子具有一对双核的孢质、极管及极质体;极管为12～13圈,为典型的微粒子属.     

东方蜜蜂微孢子虫30kD蛋白的LC-MS／MS质谱鉴定及分析

在微孢子虫（Microsporidia）侵染宿主的过程中,与侵染相关的蛋白主要分布在30kD左右。本研究分别采用煮沸法、不同浓度碱处理发芽法提取东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）蛋白并通过SDS-PAGE电泳进行比较,发现0．1mol／LKHCO3、K2CO3混合液（pH值为10．7）发芽法提取出的蛋白条带更丰富。回收30kD左右蛋白进行LC-Ms／Ms质谱测定并检索蜜蜂微孢子虫全基因组预测蛋白数据库,共鉴定获得的269个预测蛋白,匹配COG数据库后进行了蛋白功能分类。结果表明30kD蛋白主要包括翻译转录蛋白、核糖体结构蛋白、修饰蛋白、转化蛋白及分子伴侣等。从中还鉴定到与侵染相关的7种潜在孢壁蛋白（Spore wall protein,SWP）和3种极管蛋白（Polar tube protein,PTP）,并对之进行蛋白基因的序列分析,进而发现注释到的PTP1、PTP2和家蚕微孢子虫的PTP1、PTP2具有明显的共线性,其中SWP12的变异度相对较小;结合多重序列比对结果,表明SWP12在东方蜜蜂微孢子虫中是一类较保守的孢壁蛋白。本研究对于蜜蜂微孢子虫蛋白的提取方法比较和侵染相关的后选靶标蛋白的确定具有重要的参考意义。     

四种华重楼内生细菌的初步研究

从华重楼（Paris polyphylla var Chinensis）的新鲜块茎中分离得到107株内生菌．对这107株菌进行了液体培养,经初步检测鉴定,有6株菌产生薯蓣皂甙或其类似物等甾体皂甙,对其中4株菌的形态学和理化特征进行了研究,确定这4株菌分别属于德克斯氏菌属（Derxia sp）、芽孢杆菌属（Bacillus sp）、动性球菌属（Planococcus sp）、肠杆菌属（Enterobacter sp）.     

蝗虫微孢子虫对草原蝗虫感染致死作用的研究

在1.06×l0~8个孢子/ml的蝗虫微孢子虫浓度下,对青海草原蝗虫接种试验,首次从蝗尸上分离到病原物——蝗虫微孢子虫(Nosema Locustae),蝗虫致死率达50-92.1%.     

家蚕微粒子(Nosema bombycis)种群数量动态的研究

用家蚕微粒子(Nosema bombycis)对家蚕进行攻毒，诱发微粒子病发生，对染病蚕肠液、血液、体内微粒子种群数量动态分别进行了研究，结果表明：肠液内微粒子种群变化呈锯齿形上升变化，其增长规律可用一元线性回归方程表示；血液中微粒子种群随时间函数动态变化的数学模式可用3次方程来拟合；蚕体内微粒子种群则按指数增长方式随时间函数动态变化，属J型数学增长模式，从3个系统层次，3种不同的增长规律，揭示了3种完全不同的增殖机制。     

福建尖粉蝶属（鳞翅目：粉蝶科）种类及1新纪录种--兰姬尖粉蝶 Appias lalage（DoubLeday）的记述

本文记述福建尖粉蝶属（鳞翅目：粉蝶科）的3种，白翅尖粉蝶Appias albina（ BoisduvaL，1836）、兰姬尖粉蝶Appias lalage（DoubLeday，1842）和灵奇尖粉蝶Appias lyncida（Cramer，1777），其中，兰姬尖粉蝶采自福建泰宁县峨眉峰省级自然保护区，为福建分布新纪录。对这3种尖粉蝶作了简要描述，并提供福建尖粉蝶属的分种检索表。     

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及原核表达

长叶车前花叶病毒上海分离株（RMVsh)是从上海郊区的青菜（Brassica chinensis)上分离鉴定的，以提纯的病毒为材料，SDS－酚法纯化的基因组RNA作为模板，通过RT－PCR方法克服了该病毒的外壳蛋白基因（CP），DNA序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长474个碱基，编码157个氨基酸，将CP基因插入原核表达载体pBAD/His-C中，转化E.coli Top10后，诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈－特异性的蛋白条带，Western blot检测表明，表达产物与RMVsh抗血清呈阳性反应，RMVsh CP基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比，同源率分别为83．5％－98．9％和87．9％－99．4％，并讨论了RMVsh的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物2个亚组中的第一亚组的代表。     

微孢子虫感染的柞蚕蛹内细菌种群分布及遗传多样性分析

分离纯化微孢子虫感染的柞蚕蛹内单细胞微生物,采用CTAB法提取混合样品总DNA,并应用高通量SOLEXA测序技术进行测序.通过生物信息学方法进行分析比较,共鉴定了87个种,隶属于37个属17个科的细菌,主要分布在变形杆菌属Proteus、乳球菌属Lactococcus、假单胞菌属Pseudomonas、芽孢杆菌属Bacillus、肠球菌属Enterococcus等,揭示了微孢子虫感染的柞蚕蛹内细菌种群的多样性.对细菌相关基因的COG(同源蛋白簇)注释显示,参与产能及能量代谢的基因数量所占比例最多;对蛋白序列遗传距离的分析显示,编码硫胺素、二硫键分子伴侣、NADH泛醌氧化还原酶NqrA亚基等的基因在细菌种群中遗传变异相对较大,说明在蛹环境中这些参与能量代谢的相关基因变异速度加快.研究感染微孢子的宿主体内细菌物种的多样性,对于进一步挖掘微孢子虫与细菌共寄生宿主过程中的相互作用具有潜在意义.     

西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定

主要研究西沙群岛野生诺尼叶片中可培养内生菌的多样性。利用常规平板分离方法进行菌株分离。通过测定真菌核糖体基因翻译间隔序列(ITS序列)和细菌16S r DNA基因序列,结合系统发育研究对所分离菌株进行鉴定分析。共分离到32株内生菌,分为19种。其中2种霉菌,共2株,分别属于炭层菌属(Nemania sp.)和毛壳菌属(Chaetomium sp.);细菌17种,共30株,分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、土地芽孢杆菌属(Terribacillus sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)等7个已知属,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为绝对优势属,共20株,11种。     

BmNPV半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸序列研究

对家蚕核型多角体病毒苏州株（BmNPVsu）半胺氨酸蛋白酶基因（CP）的序列分析表明，该基因读码框为972个核苷酸，编码323个氨。同源性分析表明，BmNPVsu CP的氨基酸序列与不同来源的木瓜蛋白酶超家庭的CP具有较高的同源性，特别与Trpanosomabrucei的CP具有较高的一致性，达32％。在组织蛋白酶B、H、L、S以及木瓜蛋白酶的36个保守氨基酸残基中有31种出现在BmNPUsu的CP中，BmNPVsuCP同其他杆状病毒CP一样，可看作木瓜蛋白酶超家庭成员。     

中华鳖病原维氏气单胞菌的分子鉴定及分子分类学研究

气单胞菌是一类人和水产经济动物的严重致病菌,用分子进化手段鉴定一株分离自红脖子病甲鱼病灶部位的菌HBJY01,同时探讨气单胞菌的进化地位.克隆HBJY01的16S rRNA和gyrB基因,鉴定该菌的属种.用16S rRNA和gyrB基因通过构建系统进化树和计算序列两两间遗传距离的方法,探讨气单胞菌的进化地位.HBJY01的16S rRNA和gyrB基因与维氏气单胞菌的相应基因同源性最高,经分子鉴定为维氏气单胞菌.气单胞菌应独立于弧菌科,单独形成一个科,即气单胞菌科(Aeromonadaceae).     

娇导蝽属及盲异蝽属新种记述(半翅目:异蝽科)

本文记述5个发现于我国的异蝽科新种及一个新组合，分隶于桥异蝽属UrostylisWest－wood（叉娇异蝽Urostylisfurca（Lin）（新组合）；猫儿山娇异蝽UrostrylismaoershanensisRen，sp．nov．（新种）；湖北娇异蝽UrostylishubeiensisRen，sp．nov．（新种））及盲异蝽属UrolabidaWestwood（保山盲异蝽UrolabidabaoshananaRen，sp．nov．（新种）；华夏盲异蝽UrolabidasinicaRenetLiu,sp.nov.（新种）；宫本盲异蝽UrolabidamiyamotolRen，sp．nov．（新种））计6种．并提出以下的异蝽科新异名关系：Urolabidanigromarginatus(Reuter,1881）（＝UrostylisguangdongensisChen，1994，syn.nov．）;UrochelasiamensisYang1938（＝UrochelalongmenensisChen，1994,syn．nov．）     

家蚕卵蛋白的 SDS-PAGE 分析(动物科学)

本研究探讨了蛋白质提取方法、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件对家蚕卵蛋白分离效果的影响。分别用裂解液提取法、TCA沉淀法、冷丙酮沉淀法和TCA-丙酮沉淀法制备蛋白质样品,然后进行6%～12%、6%～15%两种梯度胶的SDS-PAGE,获得了不同提取方法和电泳条件下的电泳图谱用以比较家蚕卵蛋白分离效果。结果表明用TCA-丙酮沉淀法除盐,再用含9 mol.L-1尿素、4%CHAPS、1%DTT的裂解液重悬,最适合家蚕卵蛋白提取;6%～12%梯度胶对家蚕卵蛋白的分离较为适宜。利用这一优化方法对家蚕感染微孢子虫的蚕卵和正常蚕卵进行了比较研究,在分子量66 kD和85 kD处找到了与感染微孢子虫相关的蛋白,为进一步进行正常蚕卵和感染微孢子虫蚕卵的蛋白质组学研究奠定了基础。     

柞蚕微孢子虫长极丝型孢子总蛋白的鉴定及功能分析

柞蚕(Antheraea pernyi Guerin-Meneville)是中国北方重要的吐丝经济昆虫,柞蚕微孢子虫(Nosema antheraeae)引起的柞蚕微粒子病是柞蚕产业毁灭性的病害。本研究采用梯度Percoll-NaCl溶液分离纯化柞蚕微孢子虫,提取柞蚕微孢子虫总蛋白,胰蛋白酶消化,然后通过LC-MS/MS精确获得各肽段分子量,经数据库比对后共鉴定到610个蛋白。对鉴定到的蛋白质进行GO蛋白质功能分析,发现孢子时期参与大分子复合物及结构分子活性的蛋白的较多,而参与细胞催化和绑定功能、细胞过程及代谢过程的表达蛋白的所占的比例明显低于预测基因的的比例。研究认为这一结果主要与孢子期的微孢子虫脱离宿主细胞,生理不活跃,处于相对静止的时期,没有能量和物质来源有关;微孢子虫通过降低细胞活动和物质代谢,从而适应所处的环境。
     

Geobacillus sp.POT5 α-淀粉酶基因的克隆及表达

从高温环境土壤中分离到1株能在75℃生长并产生α-淀粉酶的菌株(POT5),扩增了其16Sr DNA核苷酸序列,序列分析表明该菌属于Geobacillus属.根据该属全基因序列测定数据中推定的α-淀粉酶基因,利用PCR方法从G.sp.POT5基因组中扩增得到该菌α-淀粉酶基因(amyP).序列分析表明该基因全长1.545 kb、G+C含量51.33%,编码514个氨基酸.构建重组表达质粒pET22b(+)-amyP,转化Escherichia coliBL21系统,表达产物经SDS-PAGE分析、活性染色及淀粉酶活力分析,表明amyP基因得到了表达,且产物具有生物学活性.     

果实采后病害拮抗菌的筛选及鉴定

从水果、叶片表面及果园土壤中分离到76株细菌和26株酵母菌，通过平板对峙法和果实接种法筛选到1株细菌2株酵母菌，对梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）、柑橘青霉病菌（Penicillium italicum）都表现出显著的拮抗效果．根据其形态特征和生理生化特性以及细菌的16SrDNA序列的进化树分析，初步鉴定这3株菌分别为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），假丝酵母（Candida sp．）和克勒克酵母（Kloeckea sp．）．