苏云金芽孢杆菌新分离株S_(11-11)δ-内毒素基因在Btk.BE_(20)中的克隆和表达

用对鳞翅目夜蛾科幼虫有很强毒杀作用的土壤新分离株Ｓ１１－１１为δ－内毒素基因的供体菌,以穿梭质粒ＰＨＴ３１０１为载体,用ＰｓｔⅠ和ＥｃｏＲⅠ分别对供体和载体ＤＮＡ作双酶切,并将酶切片段用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接,用电激法将重组ＤＮＡ转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株Ｂｔｋ．ＢＥ２０中,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及扫描电镜观察证明：δ－内毒素基因在Ｂｔｋ．ＢＥ２０中得到表达,并具有较高的表达量．生物测定表明,重组株对夜蛾科幼虫具有较高的毒性．此外,对质粒提取的方法也进行了讨论．     

HSV1-tk基因的部分DNA序列分析

采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＨＳＶ１０６扩增出ＨＳＶ１－ｔｋ基因（１１２８ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,然后以重组质粒ｐｃＴＫ为模板ｔｋ基因的５端引物为ＤＮＡ测序引物进行部分ＤＮＡ序列分析,部分ＤＮＡ序列分析证明ＰＣＲ产物为ＨＳＶ１－ｔｋ基因正确无误,成功筛选到ＨＳＶ１－ｔｋ基因的真核表达载体ｐｃＴＫ,并为利用ｔｋ基因在实验动物体内进行自杀性基     

农杆菌介导外源基因进入油菜的研究

用甘蓝型油菜子叶为外植体，以农杆菌共培养法将苏云金杆菌δ－内毒素基因和ＮＰＴＩ基因导入油菜．所用的农杆菌为ＬＢＡ４４０４－δ（ｄｉｓａｒｍｅｄｐＡＬ４４０４，ｐＧＡ６４３－δ）．ＰＧＡ６４３－δ为表达载体，其中克隆有ＮＰＴＩ基因和δ－内毒素基因．共培养４ｄ后，转化的子叶被转入含有卡那霉素（Ｋｍ）的分化培养基［１］上，分化出芽．被切下的芽在含有Ｋｍ的生根培养基［２］上生根，移栽后成活的小抗Ｋｍ油菜苗生长良好．用ＤＮＡ分子杂交、ＥＬＩＳＡ分析和生物测定等方法证明外源基因被转移到油菜中．     

小鼠4.5S RNA逆转座子cDNA的克隆及其表达载体的构建

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从小鼠肝脏组织总ＲＮＡ中扩增出４．５Ｓ ＲＮＡ的ｃＤＮＡ．此ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以虫荧光素酶基因作了报导基因的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０的ＰｖｕⅡ位点,构建;了４．５Ｓ ＲＮＡ逆转座子的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０－４．５Ｓ,并对４．５Ｓ ＲＮＡ逆转座子的生物学功能进行了研究。     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ。重组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔａｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５端与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）编码基因融合,阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱一步纯化,能除去绝大部分杂蛋白,基本达到纯化的效果。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫杂交分析显示,重组表达产物确系人红细胞生成素受体     

水稻矮缩病毒基因组分析与部分基因片段的表达及功能研究

根据本实验室对水稻矮缩病毒中国福建分离株基因组全序列的测定。分析了其编码蛋白的功能,并将ＲＤＶＳ６,Ｓ９,Ｓ１０,Ｓ１１编码区ｃＤＮＡ分别克隆到表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＡ,ｐＢＶ２２１,ｐＴｒｃＨｉｓＢ和ｐＢＶ２２１中,构建成表在挝 ｐＴＨ－Ｓ６,ｐＢＶＰ９,ｐＴＨ－２１０,ｐＢ－ＶＰ１１。     

小白菜苏云金牙孢杆菌CryIB基因的遗传转化

用限制ＳｐｈＩ和ＥｃｏＲＩ消化质粒ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１和ｐＢＱＸ,将ｐＢＱＸ上的经发行过的苏云金芽直菌杀虫晶体蛋白基因ＣｒｙＩＢ取代ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１上的ＧＵＳ基因,得到一个中间克隆ｐＢＩＷＩＱ－１。用限制酶ＨｉｎｄⅢ消化质粒ｐＢＩＷＩＱ－１,回收含ＣｒｙＩＢ基因的５．１ｋｂＤＮＡ乍段,插入质粒ｐＢＩＮ１９的Ｈｉｎｄ０２８３位点,构建成具卡那霉素抗性的植物表达载体ｐＢＩＷＩＱ－５．ＥＴ     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）在大肠杆菌中的表达,…

人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ重组在表达质粒ｐＤＲ７２０中。在Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００中获得了表达，表达水平为２％。以醋酸锌显色ＰＡＧＥ凝胶回收ｔ－ＰＡ表达条带，进行复性处理。复性产物经Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，Ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，纯化得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染一条带纯度，比活为４，０００ｍｏｌ／ｓ·ｇ的人ｔ－ＰＡ。     

鼻咽癌细胞株,瘤株中EBV—LMP1基因的检测及变异性分析

采用ＰＣＲ法检测了不同代次的鼻咽癌细胞株、瘤株（ＳＵＮＥ／ＳＵＮＴ）中的ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因片断，并分析其变异性。结果发现直到１３１代ＳＵＮＥ、３０代ＳＵＮＴ中仍然能检测到ＬＭＰ１基因片断，且在传代过程中ＬＭＰ１基因未发生变异。但与Ｂ９５－８中的ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因相比，ＬＭＰ１基因发生了变异，表现为Ｘｈｏｌ、Ｍｓｐ酶切位点的消失和ＳＳＣＰ单链迁移率的不同。该结果提示变异的ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因可能与ＳＵＮＥ／ＳＵＮＴ肿瘤的特性有一定的相关性。     

野油菜黄单胞菌NK－01生物合成黄原胶的分子遗传学分析

本文采用甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变野油菜黄单胞菌ＮＫ－０１得到多糖合成缺陷的不产粘突变株。经ＳａｌＩ部分酶切得到ＮＫ－０１染色体ＤＮＡ片段，将其连接到广泛寄主载体ｐＲＫ２９３上，在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中建立完整的ＮＫ－０１基因文库。在协助质粒ｐＲＫ２０１３存在下，不产多糖突变株分别与含基因文库的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落群进行三亲接合转移，筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体。对接合后体进行重组质粒的酶切分析表明，所克隆的ＤＮＡ具有片段重叠。上述重组质粒对另外９株不产多糖突变株互补检测及遗传学分析表明，１３．４ｋｂ的ＤＮＡ片段含有合成黄原胶所必需的基因。     

大肠杆菌pheA与tyrB基因的克隆与串联表达

为探讨用基因工程的手段改良苯丙氨酸的发酵菌株，采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法，从大肠杆菌总ＤＮＡ中克隆得到了编码苯丙氨酸合成途中的两个关键酶基因－即分枝酸变位酶（ＣＭ）／预苯酸脱水酶（ＰＤ）基因ｐｈｅＡ与苯丙氨酸转氨酶（ＰＡＴ）基因ｔｙｒＢ，在大肠杆菌中进行了这两个基因的单个和串联表达。ｐｈｅＡ和ｔｙｒＢ基因分别都能在λ噬菌体的ＰＲ启动子之后得到较大量的表达，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现清晰的条带，     

高等真菌LMPQ39基因文库的构建

以噬菌体λＥＭＢＬ３ＤＮＡ为载体，用ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ双切酶切后，与Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切的１０－２１ｋｂＤＮＡ片段连接，体外包装，感染Ｅ·ｃｏｌｉＬＥ３９２，所得重组子数为２．２１×１０４ｐｆｕ，超过建库所需的理论值．随机挑选的１４个克隆子，其ＤＮＡ用ＢａｍＨＩ酶切，有９个出现了不同于载体ＤＮＡ的酶切带型．     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到了重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ＨＥＰＯＲ。生组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔｑｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５’端与谷胱甘肽转移酶编码基因融合,阳性重组子在大肠村菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解     

鸡痘病毒载体强启动子的构建和筛选

根据痘苗病毒天然启动子Ｐ７．５关键区的结构,人工合成４条寡核苷酸,形成早,晚期启动子,把合成的启动子进行不同组合,得到１０个较有代表性的不同启动子组合ＰＳ１～１０,用Ｐ７．５作对照构建成表达ＬａｃＺ基因的表达载体ｐＦＢＳ１～１０以及ｐＦＢＳ７．５。利用脂质体介导转染鸡痘病毒中国疫苗株２８２Ｅ４,获取重组病毒,经纯化后,分别测重组欠代ＣＥＦ后１０,２４,３６,４８,７２ｈ,表达β－半乳糖苷酶的活性,     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。     

牛酪蛋白cDNA基因克隆的改建

牛酪蛋白全长ｃＤＮＡ克隆ｐＢａＳ１ｃ１８４Ｘ ＧＬⅢ和ＣＯｒＩ双酶切，回收基中的酪蛋白基因编码片段，与经ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ双酶切的植物表达载体ｐＢＩ１２．１２分两步连接；第一步载体的ＢａｍＨＩ末端与酪蛋白基因的ＢｇｌⅡ粘性末端连接；第二步用Ｔ４ＤＮＡ多聚酶补平酪蛋白基因的ＥｃｏＴＲⅠ末端，再与载体ＳｍａⅠ进行平末端连接而环化。     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

水稻热激蛋白基因（HSP70）的PCR法快速分析

通过比较几个已知ＨＳＰ７０的ｃＤＮＡ顺序，用ＰＣＧＥＮＥ软件中的ＰＣＲＰＬＡＮ程序设计出一对简并引物，然后从水稻（广陆矮４号）总ＤＮＡ中扩增出ＨＳＰ７０的基因片段并将其克隆到ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ载体中。在完成了对克隆的序列测定之后，用ＰＣＧＥＮＥ中有关程序对其进行同源分析，并对其他已知的ＨＳＰ７０作了一些分类及分子进化方面的探讨。     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA—28融合基因在酵母中的表达？…

采用酵母杂合启动子ＰＡＤＨＺ－ＣＵＰ１或ＰＡＤＨＺ－ＧＡＰＤＨ及终止子ＴＡＤＨ１,构建了一系列酵母表达载体。在这些表达载体中插入乙肝有面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８后将含乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒ＰＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点。     

重组质粒βhCG—pPIC9K的构建及嗜甲醇酵？…

目的：为用基因重组技术表达ｈＣＧ避孕疫苗抗原,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βｈＣＧ－ｐＰＩＣ９Ｋ,转化嗜甲醇酵母,方法：根据βｈＣＧ的ｃＤＮＡ序列设计两条引物,使上游带ＥｃｏＲⅠ酶切位点,下游带ＮｏｔⅠ酶切位点,以质粒βｈＣＧ－ＰＢＳＫＳ为模板,进行ＰＣＲ扩增反应;将所得的ＤＮＡ片段经ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切后用Ｔ４连接酶与ｐＰＩＣ９Ｋ质粒进行连接,然后导入大肠杆菌ＤＨ５α,用ＰＣＲ筛选阳性克