聚乙二醇改性壳聚糖固定化L-天门冬酰胺酶的工艺研究

采用交联法制备了聚乙二醇改性壳聚糖(PEG-CS)载体,并将其用于固定化L-天门冬酰胺酶。研究了聚乙二醇浓度、交联剂戊二醛浓度、活化剂甲醛浓度、酶溶液浓度等因素对PEG-CS固定化L-天门冬酰胺酶活力的影响。结果表明：在适当的条件下,PEG-CS固定化L-天门冬酰胺酶的活力可达20～40U／g,并且PEG-CS固定化L-天门冬酰胺酶具有良好的生化性质。     

人源蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B功能域及其全酶的原核表达及活性比较

通过设计引物,利用RT-PCR从人肝癌细胞(huh-7)中克隆蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)全长及功能域PTPc的cDNA序列并连接到pGEM-T Vector载体上,测序正确的cDNA序列连接到表达载体pET-32a(+)上,分别在大肠杆菌Transetta(DE3)和BL21(DE3)菌株中稳定表达目标蛋白,经Ni 2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯,通过酶促动力学方法分析两种蛋白的体外活性.本实验成功表达了PTP1B和PTPc可溶性蛋白,并发现Transetta(DE3)菌株较BL21(DE3)有更高的蛋白表达能力;酶促动力学分析表明,PTP1B全酶的Vmax为16.13mmol·L-1·s-1,Km为0.94mmol/L;其功能域PTPc的Vmax为5.49mmol·L-1·s-1,Km为0.54mmol/L.表明PTP1B全酶的活性高于PTPc功能域的活性.     

重组人胰岛素原在大肠杆菌中的可溶性表达

目前重组胰岛素主要用于糖尿病的治疗.通过大肠杆菌(E.coli)密码子优化,设计人胰岛素原基因,建立利用大肠杆菌表达可溶性重组胰岛素原的技术方法.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组质粒p His-Nus Ainsulin诱导表达的大肠杆菌可溶性表达融合蛋白His-Nus A-insulin.重组蛋白His-Nus A-insulin可溶性表达的最适条件为0.1,mmol/L IPTG作用下37,℃诱导4,h,重组蛋白产物经过Ni柱纯化、500,mmol/L咪唑洗脱,得到纯度较高的1.059,μg/μL的重组蛋白His-Nus A-insulin,重组蛋白His-Nus A-insulin经烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切作用后,获得可溶的人胰岛素原.     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

大肠杆菌RsmH基因克隆及表达

以大肠杆菌全基因组DNA为模版,PCR扩增目的基因rsmh,构建pMD18-T-RsmH重组克隆载体和pET-28aRsmH重组表达载体,转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达RsmH蛋白,利用重组His-tag,通过Ni-NTA亲和层析对RsmH蛋白进行纯化。SDS-PAGE对RsmH蛋白进行定性分析,考马斯亮蓝法测定RsmH蛋白含量,确认获得质量浓度为3.91 g/L纯化的rsmh表达蛋白。     

一种嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶基因在大肠杆菌中的诱导表达与活性表征

从嗜酸普鲁兰芽孢杆菌基因组中扩增出普鲁兰酶基因Pul A,并将该基因连接到大肠杆菌表达载体p ET-28a中,构建了普鲁兰酶基因的诱导表达载体p ET-28a-Pul A。测序结果表明,普鲁兰酶基因Pul A长度为2766 bp,编码922个氨基酸。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,普鲁兰酶基因Pul A在IPTG诱导下获得表达,产生胞内蛋白。SDS-PAGE测定的分子量约为110 k D。细胞超声破碎液酶活为0.45 U/m L。该酶的最适温度为55℃,最适p H为5.0,金属离子对酶活性影响不显著,具有I型普鲁兰酶特性。此重组普鲁兰酶的酶学性质表明此酶具有独特的耐酸性质,具备一定的工业化应用价值。     

ASP—ChIFN-α融合基因的构建及表达

利用PCR技术从宁夏地方三黄肉鸡肝组织中扩增出α干扰素基因,构建成原核重组表达质粒pET-28a/(ChIFN-α从埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ(L-Asmraginase,ASP)信号肽基因,并与原核重组质粒pET-28a/ChIFN-α连接,构建成分泌型表达重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α将重组质粒经IPTG诱导5 h.用SDS-PAGE分析表达蛋白含量,并用鸡α-干扰素ELISA(Western-blot)试剂盒检测表达的重组蛋白的特异性.结果表明,包涵体型重组质粒pET-28a/ChIFN-α和分泌型重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α在23 kD处均表达出目的蛋白,蛋白含量分别为27%和38%,pET-28a/ASP-ChIFN-α的蛋白表达含量比pET-28a/ChlFN-α的蛋白表达含量要高出11%,表达的重组蛋白具有特异性.实验实现了鸡α-干扰素成熟蛋白基因的高效表达,筛选出了可应用于临床的鸡α-干扰素高效表达菌株BL21(DE3)(pET-28a/ASP-ChIFN-α).     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及活性

以结核分枝杆菌H₃₇Rv基因为模板, PCR反应扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因（ICL）, 将其克隆入原核表达载体pET28b中, 并将pET28b I
CL转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达. 结果表明, ICL蛋白的最佳诱导表达条件为: 温度20 ℃, IPTG终浓度为025 mmol/L, 诱导表达4 h, 在此条件下 ICL实现了高效表达, 以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化ICL蛋白, 纯化程度较高. 酶学性质鉴定表明, 实验获得了具有生物学活性的重组蛋白, 重组ICL的比活力为24 μmol/(mg·min).     

rhBACE的克隆、表达纯化与活性测定

将重组人酸性蛋白水解酶原(rh-proBACE)基因克隆到原核表达载体pET28a质粒中，构建了pET28a-rh-proBACE重组表达载体，并在大肠杆菌菌株Rosetta中进行表达,包涵体中的表达产物溶于6mol／L盐酸胍，经Ni-Sepharose亲和层析纯化后，得到高纯度的rh-proBACE蛋白,将此蛋白在复性液中重新折叠后，于酸性条件(pH4．5)下激活，切去酶原序列，产生有活性的rhBACE蛋白，并利用人工合成多肽底物(BAS-131)测定其活性。     

重组嵌合生长抑素工程菌的构建、表达与免疫

将动物生长抑素(SS)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合基因插入p ET28a系统,构建重组质粒pET28a-A4030-2-LTB并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,获得了大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)p ET28a-A4030-2-LTB,然后使用SDS-PAGE检测该融合蛋白的表达并优化其发酵与包涵体洗涤条件,接着采用亲和层析法进行纯化,并用Western Blotting技术检测该融合蛋白的免疫原性.研究结果表明,在37℃,加入1 mmol/L的IPTG培养3 h后,融合蛋白的表达量最高且稳定表达;在包涵体洗涤的过程中,使用含有φ=1%的Triton X-100、2 mol/L尿素和0.5 mol/L NaCl的缓冲液洗涤包涵体沉淀,其效果最佳,用Western Blotting方法检测出该蛋白能发生抗原抗体反应,并且将重组蛋白免疫7只小鼠后,其中有6只小鼠产生了抗SS抗体,表达产物具有免疫原性.此研究为进一步开发生长抑素基因工程疫苗提供了可靠的实验依据.     

GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签

利用基因工程的方法,以实验室保存的p MAL-C2X-NAP质粒为模板,PCR扩增NAP基因,构建重组质粒p GEX-NAP.重组质粒通过酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),再经IPTG低温诱导获得可溶性GST-NAP融合蛋白,最后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂进行纯化,Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.结果表明,p GEX-NAP重组质粒构建正确,在大肠杆菌中经IPTG低温诱导表达,可获得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST标签后,经Western Blot验证NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.     

PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

星海链霉菌卤化酶重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.利用pET28a进行SinH表达时不能得到可溶的目标蛋白;使用含有泛素标签及内含肽的载体pHUIE实现了卤化酶蛋白SinH的可溶表达,但纯化后纯度不高;利用带有链霉菌分子伴侣蛋白基因的载体pET28a-SinH与pETcoco-pL1SL2在E.coli BL21(DE3)中共表达,在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导条件下表达4h,成功获得大量可溶蛋白,使用亲和层析(Ni-NTA)纯化,获得了较纯的目标蛋白SinH,上述研究结果为在大肠杆菌中进行其他链霉菌蛋白的可溶表达提供了参考.     

枯草芽胞杆菌谷氨酰胺转氨酶在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达及诱导条件的优化

本文通过重叠PCR技术构建获得枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)来源的谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG)(BTG)重组基因Sprodbtg,该基因依次包含SD序列、谷氨酸棒杆菌信号肽ΔS0949序列、pro D-BTG基因,并将该目的基因克隆入大肠杆菌–谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体p XMJ19中构建重组质粒p XMJ19-Sprodbtg.随后,重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中进行诱导表达,并对重组菌株的诱导条件进行优化.结果表明:重组菌株C.glutamicum ATCC13032/p XMJ19-Sprodbtg表达重组酶原蛋白pro D-BTG经活化后,BTG的活力达到(41.23±2.01)U/L;在重组菌培养12 h后诱导、IPTG终浓度0.8 mmol/L、诱导40 h的最优诱导条件下,BTG的活力达到最高,为(55.62±2.34)U/L,较优化前提高了约34.90%,.     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

酿酒酵母蔗糖酶基因的克隆、异源表达及重组酶学性质研究

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到蔗糖酶基因(suc2),并将其克隆到表达载体pSE380中,将得到的重组质粒pSE-suc2转化进E.coli BL21中,利用镍金属螯合层析方法分析测定其酶学性质。重组菌株的SDS-PAGE结果显示重组蔗糖酶基因(suc 2)有60kDa目的蛋白出现,纯化的SDS-PAGE分析得到均一的蛋白条带;重组蔗糖酶的Km值为47.73mmol/L,最大反应速率为79.59mg还原糖mg-1蛋白min-1,最适温度为42℃,最适pH值为5.5,Zn2 、Cu2 对重组蔗糖酶酶活有较强的抑制作用,Ba2 、Mg2 、Mn2 对重组蔗糖酶酶活稍有激活作用。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的克隆与表达

利用分子生物学方法对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株的亚油酸异构酶基因进行克隆与表达.培养菌体后提取总DNA,用PCR法扩增其亚油酸异构酶基因,再将其克隆到pET30a载体上,转入到大肠杆菌BL21株中表达,在低温下诱导表达出重组蛋白,并用Ni2 金属鳌合层析对重组蛋白进行分离和纯化.通过实验,得到了亚油酸异构酶的基因,成功转入到载体中,表达出了可溶性的重组蛋白,并对其进行了纯化.实验表明,在原核细胞中可以表达出可溶性重组亚油酸异构酶,以200 mmol/L的咪唑洗脱液进行洗脱可以获得目标蛋白.