恶臭假单胞菌萘质粒ⅠNL基因的克隆及酶切图谱

恶臭假单胞菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＧ７）携带的质粒ＮＡＨ７，经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ切割后，产生含有萘降解酶全部基因（２４，６ｋｂ）的片段，此片段插入到载体ｐＵＣ１１９的多克隆位点，构成了ｐＫＡＯ质粒，此质粒经ＨｐａＩ，ＥｃｏＲＩ酶切获得的５．１ｋｂ片段亚屯隆到ｐＵＣ１１９中，衍生出ｐＮＮ１质粒，绘制出内切酶图谱。从ｐＮＮＩ质粒上切下含目的基因ｎａｈＩ、ｎａｈＮ和ｎａｈＬ的ｋｐｎＩ－ｋｐｎＩ片段（２．３ｋｂ）．正向插入载体ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ＋中获得重组质粒ｐＮＮ２，反向插入为ｐＮＮ３，将其转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中，目的基因得以大量增殖。     

高等真菌LMPQ39基因文库的构建

以噬菌体λＥＭＢＬ３ＤＮＡ为载体，用ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ双切酶切后，与Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切的１０－２１ｋｂＤＮＡ片段连接，体外包装，感染Ｅ·ｃｏｌｉＬＥ３９２，所得重组子数为２．２１×１０４ｐｆｕ，超过建库所需的理论值．随机挑选的１４个克隆子，其ＤＮＡ用ＢａｍＨＩ酶切，有９个出现了不同于载体ＤＮＡ的酶切带型．     

恶臭假单胞菌萘质粒I N L基因的克隆及酶切图谱

恶臭假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｇ７）携带的ＮＡＨ７，经限制内切酶ＥｃｏＲ１切割后，产生含有萘降解酶全部基因（２４．６ｋｂ）的片段，此片段插入到载体ＰＵＣ１１９的多克隆位点，构成了ＰＫＡＯ质粒，此质粒经Ｈｐａ １，ＥｃｏＲＩ酶切获得的５．１ｋｂ片段亚克隆到ｐＵＣ１１９中，衍生出ｐＮＮ１质粒，绘制出内切酶图谱，绘制出内切酶图谱，从ＰＮＮ１质粒上切下含目的基因ｎａｈＩ、ｎａｈＮ和ｎ     

花生根瘤菌基因组文库的构建

以具有高吸Ｈ２活性的花生根瘤菌Ｌ８－３为出发菌株提取总ＤＮＡ，经ＢａｍＨＩ不完全酶切后，获得２０ｋｂ左右的ＤＮＡ片段，按Ｉｓｈ－Ｈｏｒｏｗｉｃｚ和Ｂｕｒｋｅ方法，与具有多克隆位点的ＣｏｓｍｉｄｐＬＡＦＲ３克隆载体连接，经体外包装、转导Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１，在选择培养基平板上获得１万多个重组克隆子．随机挑选２２个克隆子进行分析，其中１９个克隆子携带外源ＤＮＡ片段，平均长度为２１．４ｋｂ，文库有效克隆子数和插入ＤＮＡ片段均达到建库要求．ＰＣＲ筛选和生物素探针杂交初步结果显示，重组质粒中所携带的外源ＤＮＡ可能含有我们所需的吸Ｈ２基因．     

蓝细菌新质粒载体pPRS－1的构建

以蓝细菌Ｐｌｅｃｔｃｎｅｍａｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ。ｃｏｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａⅠ分别消化，经Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ￣ｒＴｅｔ￣ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａⅠ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子所含质粒是ｐＰｂｓ和ｐＢＲ３２２的重组质粒，定名为ｐＰＲＳ－１。     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ     

野油菜黄单胞菌NK－01生物合成黄原胶的分子遗传学分析

本文采用甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变野油菜黄单胞菌ＮＫ－０１得到多糖合成缺陷的不产粘突变株。经ＳａｌＩ部分酶切得到ＮＫ－０１染色体ＤＮＡ片段，将其连接到广泛寄主载体ｐＲＫ２９３上，在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中建立完整的ＮＫ－０１基因文库。在协助质粒ｐＲＫ２０１３存在下，不产多糖突变株分别与含基因文库的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落群进行三亲接合转移，筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体。对接合后体进行重组质粒的酶切分析表明，所克隆的ＤＮＡ具有片段重叠。上述重组质粒对另外９株不产多糖突变株互补检测及遗传学分析表明，１３．４ｋｂ的ＤＮＡ片段含有合成黄原胶所必需的基因。     

蓝细菌新质粒载体pPRS—1的构建

以蓝细胞Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ ｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ．ｃａｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａＩ分别消化，经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ＾ｒＴｅｔ＾ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａＩ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

四环素产生菌质粒DNA的分离检测及遗传学分析

用７％蔗糖的ＹＥＭＥ液体培养基培养四环素产生菌金色链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）９１－０６，以链霉菌遣传操作法为基础，从该菌体中分离到质粒ＰＳＡ３１４，分子量约为２８．５ｋｂ（１８．８ＭＤ）。该质粒经酶切分析表明，具有２个ＢａｍＨＩ位点和１个ＥｃｏＲＩ位点，用吖啶橙处理获得无质粒珠，其在孢子形成和菌落形态方面出现明显差异。     

致弱I型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ｉ型马立克病病毒（ＭＤＶ）感染的细胞基因组ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ酶切产物建于ｐＵＣ１８质粒载体文库中,以ｄｉｇｏｘｉｎｇｅｎｉｎ标记的含有中毒ＧＡ株ＭＤＶｐｐ３８基因克隆片段作为探针,进行了原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用ＥｃＲＩ酶切分析筛选到含ｐｐ３８基因同源物的重组ｐＵＣ１８质粒,序列人析表明该ｐｐ３８基因同源物与ｐｐ３８基因有极高的同源性,仅有１个碱基突变并导致１个氨基酸的夫     

具有真细菌基因启动子活性的古生菌DNA片段

以大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体经三亲本杂交用４组限制性内切酶分别消化古生菌盐生盐杆菌Ｒ１的染色体ＤＮＡ,在体外进行重组,转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ－５α感受态细胞,得到１２个转化子（Ｔ１￣和２）,其抗性水平分布在１０￣５００ｍｇ／Ｌ的区间内,将这些转化子所含质粒分别命名为ＰＳＸ１￣ＰＳＸ１２,限制性酶切分析表明,这些质粒各插入了一段不同的外源ＤＮＡ片段,杂交分析表明,抗性最强的转化子Ｔ１     

耐碱细菌NTT36耐碱基因的克隆及表达产物的分析

耐碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６总ＤＮＡ经ＥｃｏＲ１酶不完全消化,与质粒ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＲＩ酶切产物在体外重组后,转化大肠杆菌ＨＢ１０１,在碱性平板上直接筛选耐碱转化子,转化经检测具有氨苄青霉素抗体,分析表明转化子具有１５ｋｂ大小的重组质粒,用此重组质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１,ＤＨ５ａ和ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,均产生大量同时具有耐碱性和Ａｍｐ抗性的转化子,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和点杂交证明此重组质粒（定名为     

在大肠杆菌中直接克隆白腐丝状真菌-黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)基因启动子

利用启动子探钍型载体ｐＳＵＰＶ４ 直接在大肠杆菌细胞中克隆到多个来自白腐丝状真菌－黄孢平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ）的基因启动子片段．这些基因启动子片段能在大肠杆菌细胞中启动重组卡那霉素抗性基因（ｒｋａｎｒ）的表达,不同片段赋予宿主细胞以不同的卡那霉素抗性水平,最高的可达１０００μｇ／ｍ Ｌ,最低的则为５０μｇ／ｍ Ｌ．琼脂糖凝胶电泳显示这些重组质粒ＤＮＡ 中均有不同大小的插入片段,其范围是０．５～６．０ｋｂ．选取一个插入３．９ｋｂ 的重组质粒ｐＰＣ３３ 所作的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交结果表明,插入片段以单拷贝形式存在于Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ 的基因组中．当此片段５′－端被除去１．８ｋｂ 后,余下的２．１ｋｂ 片段可使融合的Ｋａｎｒ 基因的表达效率提高６０％ ．     

旋毛虫排泄分泌抗原p49基因的克隆

应用ＤＮＡ重组技术将编码旋毛虫肌幼虫４９ＫＤａ抗原的基因克隆于大肠杆菌中．设计特异的ＰＣＲ引物,用ＰＴ－ＰＣＲ技术直接从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中反转录并扩增出约１．１Ｋｂ的靶ＤＮＡ．用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶解后将其克隆到质粒载体ｐＵＣ１９中,用Ｘ－ｇａｌ培养基筛选重组子．该重组子经相同的核酸内切酶水解获得约２．７Ｋｂ和１．１Ｋｂ两个片段,分别与ｐＵＣ１９和目的基因的大小相同,目的基因经序列分析并与文献报道的序列比较发现具有９７．８％的同源性．     

河田鸡线粒体DNA物理图谱

运用差速离心法、蛋白酶Ｋ及ＲＮａｓｅ消化法制备并纯化河田鸡（ＧａｌｕｓｇａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓＨｅｔｉａｎｂｒｅｅｄ）的线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）．用１１种限制酶对其进行单酶切分析,结果表明,ＡｖａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、ＰｖｕⅡ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ和ＳｔｕＩ在河田鸡ｍｔＤＮＡ上分别有５、２、４、５、１、３、４、３、３和＞９个酶切位点,Ｓｃａｌ在不同个体河田鸡ｍｔＤＮＡ上检测出两种限制性格局,分别有２和３个酶切位点．此外,还用ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、ＰｖｕⅡ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ和ＳｃａＩ进行双酶切,构建了ｍｔＤＮＡ的物理图谱     

HSV1-tk基因的部分DNA序列分析

采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＨＳＶ１０６扩增出ＨＳＶ１－ｔｋ基因（１１２８ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,然后以重组质粒ｐｃＴＫ为模板ｔｋ基因的５端引物为ＤＮＡ测序引物进行部分ＤＮＡ序列分析,部分ＤＮＡ序列分析证明ＰＣＲ产物为ＨＳＶ１－ｔｋ基因正确无误,成功筛选到ＨＳＶ１－ｔｋ基因的真核表达载体ｐｃＴＫ,并为利用ｔｋ基因在实验动物体内进行自杀性基     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

小白菜苏云金牙孢杆菌CryIB基因的遗传转化

用限制ＳｐｈＩ和ＥｃｏＲＩ消化质粒ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１和ｐＢＱＸ,将ｐＢＱＸ上的经发行过的苏云金芽直菌杀虫晶体蛋白基因ＣｒｙＩＢ取代ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１上的ＧＵＳ基因,得到一个中间克隆ｐＢＩＷＩＱ－１。用限制酶ＨｉｎｄⅢ消化质粒ｐＢＩＷＩＱ－１,回收含ＣｒｙＩＢ基因的５．１ｋｂＤＮＡ乍段,插入质粒ｐＢＩＮ１９的Ｈｉｎｄ０２８３位点,构建成具卡那霉素抗性的植物表达载体ｐＢＩＷＩＱ－５．ＥＴ     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到了重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ＨＥＰＯＲ。生组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔｑｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５’端与谷胱甘肽转移酶编码基因融合,阳性重组子在大肠村菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解