病毒载体滴度对基因转移效率的影响研究

用改良的经典方法测定包装ＬａｃＺ基因的腺病毒和逆转录病毒载体的病毒滴度，以及用新建的简便方法测定逆转录病毒载体的病毒滴度．应用此两种病毒载体介导ＬａｃＺ基因分别导入１５种人或小鼠靶细胞，并以不同滴度的病毒上清液转染靶细胞Ｋ５６２，探讨病毒滴度对基因转移效率的影响．实验结果表明，病毒滴度与转染效率呈正相关，逆转录病毒滴度由１０６ＣＦＵ／ｍＬ降至１０４ＣＦＵ／ｍＬ时，用其转染Ｋ５６２细胞的转染效率由９０％降至２０％；ＣＡ启动子腺病毒滴度由０．４×１０９ＣＦＵ／ｍＬ降至０．２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ时，对Ｋ５６２细胞的转染率由１００％降至３５％．同时表明，腺病毒滴度高，其转染率亦远比逆转录病毒高     

腺病毒介导的wtp53基因对五种癌细胞系的生长抑制 …

构建重组腺病毒载体ＡｄＣＭＶｐ５３，将ｗｔｐ５３分别导入ＰＧ（人肺巨细胞瘤细胞）、ＣＡＥ（人结肠癌细胞）、ＨＣＴ（人结肠癌细胞）、ＨｅＬａ９人宫颈癌细胞）及ＢＥＬ７４０２（人肝癌细胞）五种癌细胞中，测定ＡｄＣＭＶｐ５３对癌细胞的半抑制浓度（ＩＣ５０）和细胞生长曲线，分别不同组织癌组织对ＡｄＣＭＶｐ５３的敏感程度。结果表明，ＡｄＣＭＶｐ５３对癌细胞具有与病毒剂量相关的明显致死作用，但不同细胞对腺病毒     

形成多角体家蚕重组病毒通用转移载体构建

从家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）通用转称载体ｐＢＫ２８３和粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）转移载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列出发，构建了一个７．２ｋｂ能形成多角体且可以用于克隆含不同读码框外源基因的ＢｍＮＰＶ通用转移载体系列ｐＢＭＸ３．ｐＢＭＸ３系列以ＢｍＮＰＶ多角体结构基因上游的１．９ｋｂ和下游１．３ｋｂ的片段作为与ＢｍＮＰＶ基因组进行体内同源重组的同源序列；ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列的ＳＸＩＶ双启动子用于外源基因的表达；ＡｃＮＰＶ的多角体基因作为重组病毒形成多角体的基因．以ＢｍＮＰＶ－ＬａｃＺ（ｏｃｃ－ｇａｌ＋）为出发株病毒，ｐＢＭＸ３系列的重组病毒筛选有ｏｃｃ＋和ｇａｌ－两个遗传标记     

腺相关病毒介导带基因座控制区核心序列的β—珠蛋白基因在红？…

为提高人β－珠蛋白基因在基因转移中的稳定性与在红系细胞中的表达水平，构建了带单个和多个基因座控制区核心序列的人β－珠蛋白基因相关病毒（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）载体ＡＶ５３ＨＳ２△β２Ｎｅｏ和ＡＶ５３ＨＳ４３２△β２Ｎｅｏ。利用ＡＡＶ载体介导的基因转移将两种重组体导入红系细胞（ＭＥＬ），分析了它们在ＭＥＬ细胞中的整合与表达。结果表明，ＡＡＶ载体介导带多个基因座控制区核心序     

腺病毒载体介导胸苷激酶基因／ACV对大鼠脑胶质瘤的离体和活？…

建立缺陷型重组腺一贯工体介导的胸苷激基因治疗系统，进行离体和活体治疗大鼠Ｃ６脑胶质瘤研究，将质粒ｐＡｄｔｋ与ｐＪＭ１７共染腺病毒懈装细胞－２９３细胞，同源重组后制备纯化的Ａｄｔａｋ并以ＰＣＲ证实；     

带HSV－tk基因的重组腺病毒杀伤离体肺癌细胞的研究

带有单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的腺病毒结合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）对分裂细胞有很强的杀伤作用．在感染复数（Ｍ．Ｏ．Ｉ,ＭｕｌｔｉＰｌｉｃｉｔｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ）达到１０００时对人体肺腺癌细胞Ａ５４９的杀伤几乎达到１００％．四种人体肺癌细胞株（Ａ５４９,ＬＡＸ,ＳＰＣ,ＳＫＹ）对带ＨＳＶ－ｔｋ的腺病毒（ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ）的杀伤作用表现出不同的敏感性．另Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＡＣＶ）和ＧＣＶ对感染了重组腺病毒ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ的细胞都有一定杀伤作用,但杀伤效果有很大差别;就Ａ５４９而言,ＧＣＶ的杀伤作用比ＡＣＶ高７～８倍．此外ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ结合ＧＣＶ杀伤肿瘤细胞时有“旁观者效应”,即感染了ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ的细胞与未感染细胞混合后,后者也明显地遭到杀伤．     

病毒载体滴度对基因转移效率的影响研究

用改良的经典方法测定包装ＬａｃＺ基因的腺病毒和逆转录病毒载体的病毒滴度，以及用新建的简便方法测定逆转录病毒载体的病毒滴度，应用此两种病毒载体介导ＬａｃＸＺ基因分别导入１５种人或小鼠靶细胞，并以不同滴度的病毒上清液转染靶细胞Ｋ５６２，探讨病毒滴度对基因转移效率的影响，实验结果表明，病毒滴度与转染效率呈正相关，逆转录病毒滴度由１０＾６ＣＦＵ／ｍＬ。     

AcNPV增强子hr5增强HBsAg基因表达的研究

用形成包涵体（ＯＯＣ＋）并能利用人工合成启动序列和多角体ＸＩＶ启动子表达外源基因的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３将多角体基因、乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢＳＡｇ）基因和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的增强子ｈｒ５部分序列同时插入无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－Ｇ基因组中，得到两株高效表达ＨＢｓＡｇ基因又形成包涵体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋．对重组病毒的酶切鉴定、ＤＮＡ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，外源基因及其相应的启动子和增强子序列已正确插入病毒基因组中．插入顺序中，ｈｒ５增强子是插入ＨＢｓＡｇ基因下游，多角体基因与ＨＢｓＡｇ基因方向相反．１２５Ⅰ－固相放射免疫检测和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＨＢｓＡｇ基因在昆虫离体细胞中得到高效表达并保留了抗原活性．ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋表达的ＨＢｓＡ吕蛋白与没有插入增强子序列的重组病毒ＴｎＮＰＶ—ＨＢｓ８５－ＯＣＣ＋的比较，分别提高了４０％和４６％．     

电击法转移含人凝血因子Ⅸ基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者含ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸ ｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动子控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动子驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１     

猪瘟病毒E2基因pGEME2重组质粒仍具有α互补作用

在利用ＰＧＥＭ－Ｔ载体克隆猪瘟病毒石门株Ｅ２基因中发现，Ｅ２基因以与ｌａｃＺ相同方向插入时，重组质粒仍具有α互补作用，叶典型的蓝色菌落，而以与ｌａｃＺ基因相反方向插入时，重组质粒无α互补作用，呈白色菌落，经Ｅ２蛋白检测、序列分析、重组质粒缺失和插入等研究，结果表明，ＰＧＥＭＥ２的α互补作用产生机制不同于目前人们已知的机制，它由外源Ｅ２基因内部起始合成新的α肽，从而赋于其α互补作用，此结果表明利用α     

电击法转移含人凝血因子IX基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒颗粒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者合ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动于控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动于驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１０８０细胞中的ＦＩＸ表达量分别为２２０、２１２ｎｇ／（１０６细胞·２４ｈ）通过与ｐＣＭＶＩＸ共转染靶细胞，可以增加人ＩＸ因子表达１．５～３．５倍，显示了用质粒载体转染靶细胞在血友病Ｂ基因治疗中是一条潜在可行的途径．本项研究用自制的电击仪转移ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０等细胞，最高的转移效率达１０－３，并探讨了细胞种类，ＤＮＡ量，ＤＮＡ结构，电压，脉冲时间与转移效率及表达量的关系．     

全长和截短的δ内毒素cryIAc基因在昆虫杆状病毒表达？…

在昆虫病毒转移载体ｐＶＬ１３９３多角体基因启动子下游克隆了全长的苏芸金杆菌δ内毒素基因ｃｒｙＩＡｃ，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ１，用ＫｐｎＩ将ｃｒｙＩＡｃ基因进行了截短，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ２。随后在两种重组转移载体ｃｒｙ基因的下游引入了ＩＥ１启动子驱动的ｎｅｏ基因作为筛选标记和ＳＶ４０小ｔ抗原终止区作为ｃｒｙ基因的终止信号，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ１ｎｅｏ和ｐＶＬＹ２ｎｅｏ，分别用两种重     

带HSV—tk基因的重组腺病毒杀伤离体肺癌细胞的研究

带有单纯疱疹病毒脱氧苷激酶基因的泉病毒结合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）对分很强的杀伤作用。在感染复数（Ｍ。Ｏ。ＩＭｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）达到１０００时对人体肺腺癌细胞Ａ５４９的杀伤几乎达到１００％。四种人体肺癌细胞株（Ａ５４９，ＬＡＸ，ＳＰＣ，ＳＫＹ）对带ＨＳＶ－ｔｋ的泉病毒（ＡＤＶ／ＲＳ－ｔｋ）的杀伤作用表现出不同的敏感性。但杀伤效果有很大差别；就Ａ５４９而言，ＧＣ     

HVTG非必需基因区鉴定及含MDVgB基因重组病毒的构建

以火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）约８．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ ＤＮＡ克隆片段中的ＢａｍＨＩ ＨｉｎｄⅢ亚克隆片段为同源序列,将大肠杆菌β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）基因作为报告基因,通过同源重组,获得了表达ＬａｃＺ基因产物的重组ＨＶＴ（ＬａｃＺ－ｒＨＶＴ）。经本内,体外传代表明重组病毒中的ＬａｃＺ基因表达稳定,同时证明该亚克隆片段属于ＨＶＴ复制的非必需基因。在此基础上,将Ｉ型马立克氏病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）     

野生型p53基因重组体腺病毒介导的肿瘤抑制作用

采用同源重缚方法构建了野生型ｐ５３全长ｃＤＮＡ的重组体腺病毒，通过转导人卵巢癌细胞系ＳＫ－ＯＶ－３和黑色素瘤细胞系ＷＭ－９８３Ａ，证实腺病毒能介导ｐ５３基因进行有效转移，并能显著抑制这两种肿瘤细胞的生长和集落形成能力，生长抑制率分别这到９３％和８６％，对两种肿瘤细胞裸鼠皮下移植瘤的治疗实验表明，ｐ５３能明显抑制肿瘤的生长，流式细胞计数ＤＮＡ片段化及ＴＵＮＥＬ分析证实，Ｐ５３可诱导肿瘤细胞凋亡和Ｇ１     

重组人钙调素的表达及其McAb的制备与精子CaM定位

用基因重组技术构建人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃＤＮＡ）表达载体ｐＢＶ／ｈＣａＭⅢ,并在大肠杆菌ＤＨ５α中经热诱导获得可溶性ＣａＭ蛋白的高效表达．将纯化的重组ｈＣａＭ与异型双功能剂ＳＰＤＰ及鼠血清白蛋白（ＭＳＡ）交联,免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,用常规细胞融合技术制备单克隆抗体（ＭｃＡｂ）,得到３株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞．间接ＥＬＩＳＡ和斑点免疫结果证实,三种单克隆抗体均与自制的ｒｈＣａＭ和ＣａＭ标准品起特异反应．用免疫组化法对精子中ＣａＭ定位,发现ＣａＭ主要分布于精子头颈部,不育组ＣａＭ＋精子率（（４５．０±７．５）％）显著低于生育组（（６８．５±１０．５）％）．     

针对马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变酶的克？…

根据特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）复制酶基因负链ＲＮＡ的锤头状核酶，设计、合成了编码与其相应的突变核酶的ｃＤＮＡ，并克隆到质粒ｐＧＥＭ－４Ｚ中，经序列分析及体外转录表明得到寒带的突变核酶基因重组质粒，从而为突变核酶的转基因及进上频琛麦在转基因马铃薯中表达引韦的抗性及机理创造的条件。     

大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因在小菜蛾细胞中的表达

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的杆状病毒转移载体．ｐＡｃ３６０－β－ｇａｌ与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－ＰＸ２－ＨＮＵ２,Ｐｘ）,利用Ｘ－ｇａｌ空斑检测分析,β－ｇａｌ基因成功地插入ＡｃＮＰＶ基因组中,得到重组病毒Ａｃ－β－ｇａｌ,重组病毒在Ｐｘ细胞中表达出受ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因启动子控制的具有生物活性的外源基因表达产物──β－ｇａｌ．     

乙型肝为病毒（HBV）DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游,重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达,用纯化后的重组质粒直接注射用ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼细内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体,ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合。     

乙型肝炎病毒(HBV)DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游．重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达．用纯化后的重组质粒直接注射到ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼肌内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体．ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合