小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的建立小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 方法,并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI 上发表的MVM( NC_001510) 基因组序列,设计引物和探针,建立MVM 荧光定量PCR 方法。考察引物探针的最佳线形范围,特异性及灵敏度,并使用该方法对178 份清洁级小鼠粪便DNA 样本进行检测。结果MVM 荧光定量PCR 方法最佳线性范围为109 ～ 104 拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2 值可达0. 99,灵敏度为101 拷贝/μL,特异性强,与大鼠细小病毒H-1 株和KRV 株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR 方法对178 份小鼠粪便DNA进行检测,结果均为阴性。结论建立的MVM 荧光定量PCR 方法具有特异、灵敏的特点,为MVM 的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。     

小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立小鼠巨细胞病毒(Mouse Cytomegalovirus,MCMV)荧光定量PCR方法并对其进行初步应用。方法 选取NCBI发表的MCMV Smith株DNA polymerase基因保守序列设计引物探针,建立MCMV的荧光定量PCR方法,对方法的特异性、敏感性、重复性及稳定性进行验证,并应用该方法检测掺入MCMV的小鼠血液样品及2018年度送检的409份小鼠血液样本。结果 建立的MCMV荧光定量PCR方法标准曲线Slope为-3. 418,R2值为0. 999,扩增效率为96. 137%,可定量检测到的MCMV最低含量为47 copies/μL。以大鼠巨细胞病毒,猴巨细胞病毒,人单纯疱疹病毒,伪狂犬病毒及猫疱疹病毒I型为模板均无扩增曲线,特异性良好。方法组内和组间变异系数分别为0. 39%～0. 68%和0. 48%～1. 01%,重复性和稳定性好。可检测到掺入小鼠血液样品中MCMV病毒的最大稀释度为1∶1000(100. 75 TCID50/0. 1 m L),409份小鼠血液样品经检测均为阴性。结论 建立的小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR方法有很好的敏感性、特异性及稳定性,可有效地检测小鼠中MCMV,为实验小鼠MCMV的监测及相关标准的补充完善提供了技术参考。     

小鼠巨细胞病毒PCR 诊断方法的建立及其应用

摘要: 目的建立小鼠巨细胞病毒( MCMV) PCR 检测方法,并进行初步应用。方法根据NCBI 公布的巨细胞病毒设计引物,进行PCR 体系优化、敏感性、特异性测试; 运用优化后的方法,对87 份小鼠血清进行检测,对阳性样本进行测序分析。结果建立的小鼠巨细胞病毒PCR 方法灵敏度高,特异性好,初步检测4 个屏障设施的87 份小鼠血清, 13 份为阳性,通过测序证实为小鼠巨细胞病毒,验证了此方法的可行性。结论为小鼠巨细胞病毒的快速检测提供了方法。     

小鼠腺病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

目的基于TaqMan建立小鼠腺病毒(MAdV)特异的荧光定量PCR检测方法,用于调查长爪沙鼠和小鼠等实验动物中MAdV感染情况。方法从NCBI下载小鼠腺病毒(MAdV-A和MAdV-3)基因组序列,比对分析后选择保守性较好的基因设计引物和探针。筛选最佳引物对和探针,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证,运用所建立的方法对长爪沙鼠和野鼠的共41份样本进行检测。结果经特异性和灵敏度鉴定,在设计的3对引物探针中确定一对最佳引物探针MAD-3,可区分小鼠腺病毒与猴腺病毒、禽腺病毒和树鼩腺病毒等24种病原,MAdV质粒DNA最低检测限为4.5 copies/reaction;MAdV纯病毒液和病毒/组织模拟样本的最低检测限均为440 copies/reaction。结论建立的Taq Man荧光定量PCR检测方法特异、灵敏和稳定,可用于大鼠、小鼠、长爪沙鼠等实验动物及鼠源性生物制品MAdV的检测。     

鼠脑心肌炎病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立快速诊断鼠脑心肌炎病毒感染的荧光定量RT-PCR方法。方法根据鼠脑心肌炎病毒(EMV)PEC9毒株全基因组序列(Gen Bank登录号:DQ288856.1),设计一对特异性引物和TaqMan探针,建立EMV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果建立的荧光定量PCR方法,标准曲线的线性关系良好,r2值可达0.99,敏感性最低检测限为1个拷贝数,高于普通PCR方法 1000倍,其特异性强,与其他常见感染的小鼠病毒株均无特异性扩增,批内和批间变异系数均小于2%。利用该方法对上海市120份小鼠心肌样品进行检测,未检测到阳性感染。结论本研究为鼠脑心肌炎病毒感染的分子检测,为制定国家标准提供良好的方法。     

实验动物雪貂阿留申病病毒核酸检测方法的建立

目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测。方法 参考Genebank中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查。结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90. 6 copy/μL。应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性。结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法。     

猫细小病毒 PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的 建立猫细小病毒 PCR 检测方法,应用于猫临床样本中 FPV 的快速检测。方法 根据已发表的 FPV VP2 基因序列设计合成引物,并以此建立 FPV 的 PCR 检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。 用建立的方法对 33 份猫临床样品进行检测。结果 建立的 FPV PCR 检测方法与猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)、猫冠 状病毒(FeCV)、猫合胞体病毒(FeSFV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为 5lgTCID50 / mL,相应的 DNA 模板浓度为 4. 9 × 102 拷贝/μL;FPV DNA 在 － 30℃冰箱放置 12 个月仍可检测出目的条带。应用 该方法从 33 份猫临床样本中检测出 21 份 FPV 核酸阳性。结论 建立的 FPV PCR 检测方法具有特异、敏感及稳定 的特点,适合于临床 FPV 的感染检测。     

两种国产与一种进口小鼠肝炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较研究

目的 本研究拟对比小鼠肝炎病毒( MHV)抗体 ELISA 检测试剂盒的敏感性、特异性、精密性和可信度,以筛选出既经济又可靠的检测试剂盒。 方法 选择两种国产与一种进口的 ELISA 试剂盒检测 MHV 抗体和以下 5 种病毒阳性血清:小鼠仙台病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠细小病毒(MVM)、小鼠鼠痘病毒(MPV)及小鼠呼肠孤Ⅲ型病毒(Reo-3),并进行敏感性、特异性、精密性及可信度实验比较。 结果 ELISA 国产 B 试剂盒的敏感性是国产 A 试剂盒的 400 倍,进口试剂盒的敏感性是国产 B 试剂盒的 4 倍;特异性实验显示国产 A 试剂盒与 MPV 无交叉反应,但与其他 4 种病毒阳性血清均有交叉反应,国产 B 试剂盒和进口试剂盒与 MPV 以外的 5 种病毒阳性血清均无交叉反应;精密性实验显示进口试剂盒批内平均变异系数为 5. 667%,国产 A 和国产 B 试剂盒批内平均变异系数分别为13. 825%和 13. 827%;可信度实验显示国产 B 试剂盒和进口试剂盒的阳性和阴性检测符合率均为 100%,国产 A 试剂盒的阳性和阴性检测符合率分别为 40%和 80%。 结论 ELISA 检测国产 B 试剂盒除敏感性和精密度低于检测的进口试剂盒外,其特异性和可信度均良好,国产 A 试剂盒的敏感性、特异性、精密性和可信度均低于检测的进口试剂盒。     

仙台病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立及初步应用

目的 建立敏感特异的仙台病毒( SeV)荧光定量 PCR 检测方法,并初步应用。 方法 将不同株 SeV 病毒序 列进行比对,选择对保守区域设计合成引物。 人工合成 SeV 基因组 12 181 ~ 12 480 DNA 序列,转入质粒中,作为仙 台病毒质粒标准品,建立 SYBR 染料法荧光定量 PCR 方法,并对样本进行 SeV 测定。 结果 建立了特异性的检测 SeV 的 SYBR 荧光定量 PCR 方法,该方法对 SeV 最低检测限度为 10 copies / μL。 将所建立的实时荧光定量 PCR 方 法用于 40 只 SPF 小鼠和 58 只裸鼹鼠的肺组织样本的检测,检测结果为仙台病毒核酸阴性;检测 4 只成年屏障环 境饲养黄鼠肺组织和 5 只清洁级小鼠肺组织,检测结果为仙台病毒核酸阳性率 100% 。 结论 该研究建立的 SYBR Green 染料法荧光定量 PCR 方法能特异敏感地检测仙台病毒。     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

应用实时荧光定量PCR方法检测实验用猫巴尔通体的感染

目的 建立高效特异的巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法,并应用于实验用猫的微生物检测工作中。方法 针对NCBI公布的巴尔通体序列设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对142个猫样品进行检测。结果 成功建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为1.0×101 copies/μL～1.0×109 copies/μL,相关系数为0.998,检测极限达10 copies/μL;特异性结果显示所建方法具有良好的特异性,并在142份实验用猫样品中检测出阳性样品6份。结论 实时荧光定量PCR方法可用于实验用猫巴尔通体的检测工作中。     

鼠痘病毒PCR检测方法的建立及在鼠源性生物制品检定中的应用

目的建立小鼠鼠痘病毒PCR检测方法,并应用于鼠源性生物制品的检测。方法根据鼠痘病毒基因组序列中保守的crmD片段设计一对引物,建立鼠痘病毒PCR检测方法;人工感染20只小鼠,对其肝、脾、肾、脚掌及血液采用该方法进行检测;提取鼠源性生物制品中DNA,采用该方法检测其是否存在鼠痘病毒。结果该方法可以检测到稀释至10-5感染鼠痘病毒的细胞,在BHK21细胞和牛痘病毒中均未扩增出相应片段;该方法可检测出人工感染小鼠不同组织中病毒DNA;在鼠源性生物制品中未检测出鼠痘病毒DNA。结论该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于染病动物组织及鼠源性生物制品中鼠痘病毒的检测。     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

布吉河枯水期总细菌和反硝化功能基因定量研究

为了研究污染河流中微生物群落结构的存在状况及与水环境因子的关系,以深圳市深圳河的一级支流布吉河为研究对象,采用DGGE和Q-PCR技术分析了布吉河不同断面水样和沉积物中总细菌数量和群落结构以及反硝化基因(nosZ和narG基因)数量变化。结果表明,水样中总细菌数量的变化范围为5.77×108~7.13×1011copies/L,nosZ和narG基因数量的变化范围分别为2.99×106~9.39×108copies/L和1.45×107~9.11×109copies/L。沉积物中总细菌数量的变化范围为1.14×109~1.61×1011copies/g,nosZ和narG基因数量的变化范围分别为1.52×106~3.80×107copies/g和2.38×107~2.93×108copies/g。由于生境的差异,沉积物中nosZ和narG基因丰度高于水样。冗余度分析表明,影响微生物数量和群落结构的水环境因子不同,Fe是影响布吉河水样中细菌数量的主要水环境因子,而COD、亚硝氮和硝氮是影响布吉河微生物群落结构的主要水环境因子。水样和沉积物中微生物生态功能都很稳定,但水样中总细菌多样性比沉积物中高。     

快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的5′端非编码区设计一对引物和一条TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了特异性检测HCLV的荧光定量RT-PCR方法．结果表明：该方法检测的最低拷贝数为45拷贝／μL,灵敏度比普通PCR方法高10^4倍,在较广的范围内（4．5×10^1-4．5×10^6拷贝／μL）有良好的线性关系（r=0．994）;分别以乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、牛病毒性腹泻,黏膜病病毒作为模板进行TaqMan RT-PCR扩增,未出现阳性信号：4个不同浓度标准品组内试验变异系数为1．90％～5．82％,组间试验变异系数为4．02％～5．69％：HCLV3个cDNA样本组内试验变异系数为3．72％～4．93％;组间试验变异系数为2．99％～4．02％．该方法具有很好的灵敏性、特异性及稳定性,能够快速准确定量检测HCLV,为HCLV疫苗的研制、猪瘟病毒分子生物学等方面研究提供了一种快捷有效的工具．     

SPF级实验小鼠4种致病菌多重PCR方法的建立及优化

目的 建立一种可同时检测4种SPF级屏障环境常见致病菌的多重PCR方法。方法 本研究针对鼠伤寒沙门氏菌invA基因、肺炎克雷伯杆菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、铜绿假单胞菌ecfX基因序列分别设计合成特异性引物,构建可同时鉴别4种菌的多重PCR反应体系,优化后测定其特异性、灵敏性并人工模拟感染样本。结果 建立的4重PCR方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增,无交叉反应;对4种目的菌的检测灵敏度为10-3ng/μL;也可从混合感染的病料中特异性地检测出4种致病菌。结论 本试验建立的多重PCR方法具有快速、简便、灵敏的特点,为4种致病菌的快速诊断和监控提供了有效的技术支持。