苏云金芽孢杆菌新分离株S11—11δ—内毒素基因在Btk.BE …

用对鳞翅目夜蛾科幼虫有很强毒杀作用的土壤新分离株Ｓ１１－１１为δ－内毒素基因的供体菌，以穿梭质粒ＰＨＴ３１０１为载体，用Ｐｓｔ Ｉ和ＥｏｏｒＩ分别对供体和载体ＤＮＡ作双酶切，并将酶切片段用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接，用电激法将重组ＤＮＡ转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株Ｂｔｋ．ＢＥ２０中，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及扫描电镜观察证明，δ－内毒素基因在Ｂｔｋ．ＢＥ２０中得到表达，并具有较高的表达量。生物测定     

HSV1-tk基因的部分DNA序列分析

采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＨＳＶ１０６扩增出ＨＳＶ１－ｔｋ基因（１１２８ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,然后以重组质粒ｐｃＴＫ为模板ｔｋ基因的５端引物为ＤＮＡ测序引物进行部分ＤＮＡ序列分析,部分ＤＮＡ序列分析证明ＰＣＲ产物为ＨＳＶ１－ｔｋ基因正确无误,成功筛选到ＨＳＶ１－ｔｋ基因的真核表达载体ｐｃＴＫ,并为利用ｔｋ基因在实验动物体内进行自杀性基     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ。重组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔａｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５端与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）编码基因融合,阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱一步纯化,能除去绝大部分杂蛋白,基本达到纯化的效果。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫杂交分析显示,重组表达产物确系人红细胞生成素受体     

农杆菌介导外源基因进入油菜的研究

用甘蓝型油菜子叶为外植体，以农杆菌共培养法将苏云金杆菌δ－内毒素基因和ＮＰＴＩ基因导入油菜．所用的农杆菌为ＬＢＡ４４０４－δ（ｄｉｓａｒｍｅｄｐＡＬ４４０４，ｐＧＡ６４３－δ）．ＰＧＡ６４３－δ为表达载体，其中克隆有ＮＰＴＩ基因和δ－内毒素基因．共培养４ｄ后，转化的子叶被转入含有卡那霉素（Ｋｍ）的分化培养基［１］上，分化出芽．被切下的芽在含有Ｋｍ的生根培养基［２］上生根，移栽后成活的小抗Ｋｍ油菜苗生长良好．用ＤＮＡ分子杂交、ＥＬＩＳＡ分析和生物测定等方法证明外源基因被转移到油菜中．     

甘薯储藏蛋白(sporamin)A基因在大肠杆菌中的表达研究

利用基因重组技术,将ＰＣＲ扩增获得的甘薯储藏蛋白Ａ基因的成熟肽编码区序列,插入到高效表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＢ中,构建成重组表达质粒ｐＴＨＳＰＯ－Ａ,用限制酶切和ＰＣＲ分析均表明重组质粒与预期结果相符,用ＩＰＴＧ诱导重组质粒转化的大肠杆菌ＴＯＰ１０。菌体总蛋白经１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一个大小为１０ｋＤ的蛋白质带,其分子量比预期值小。     

鸡痘病毒载体强启动子的构建和筛选

根据痘苗病毒天然启动子Ｐ７．５关键区的结构,人工合成４条寡核苷酸,形成早,晚期启动子,把合成的启动子进行不同组合,得到１０个较有代表性的不同启动子组合ＰＳ１～１０,用Ｐ７．５作对照构建成表达ＬａｃＺ基因的表达载体ｐＦＢＳ１～１０以及ｐＦＢＳ７．５。利用脂质体介导转染鸡痘病毒中国疫苗株２８２Ｅ４,获取重组病毒,经纯化后,分别测重组欠代ＣＥＦ后１０,２４,３６,４８,７２ｈ,表达β－半乳糖苷酶的活性,     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到了重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ＨＥＰＯＲ。生组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔｑｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５’端与谷胱甘肽转移酶编码基因融合,阳性重组子在大肠村菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解     

重组质粒βhCG—pPIC9K的构建及嗜甲醇酵？…

目的：为用基因重组技术表达ｈＣＧ避孕疫苗抗原,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βｈＣＧ－ｐＰＩＣ９Ｋ,转化嗜甲醇酵母,方法：根据βｈＣＧ的ｃＤＮＡ序列设计两条引物,使上游带ＥｃｏＲⅠ酶切位点,下游带ＮｏｔⅠ酶切位点,以质粒βｈＣＧ－ＰＢＳＫＳ为模板,进行ＰＣＲ扩增反应;将所得的ＤＮＡ片段经ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切后用Ｔ４连接酶与ｐＰＩＣ９Ｋ质粒进行连接,然后导入大肠杆菌ＤＨ５α,用ＰＣＲ筛选阳性克     

牛酪蛋白cDNA基因克隆的改建

牛酪蛋白全长ｃＤＮＡ克隆ｐＢａＳ１ｃ１８４Ｘ ＧＬⅢ和ＣＯｒＩ双酶切，回收基中的酪蛋白基因编码片段，与经ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ双酶切的植物表达载体ｐＢＩ１２．１２分两步连接；第一步载体的ＢａｍＨＩ末端与酪蛋白基因的ＢｇｌⅡ粘性末端连接；第二步用Ｔ４ＤＮＡ多聚酶补平酪蛋白基因的ＥｃｏＴＲⅠ末端，再与载体ＳｍａⅠ进行平末端连接而环化。     

AcNPV增强子hr5增强HBsAg基因表达的研究

用形成包涵体（ＯＯＣ＋）并能利用人工合成启动序列和多角体ＸＩＶ启动子表达外源基因的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３将多角体基因、乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢＳＡｇ）基因和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的增强子ｈｒ５部分序列同时插入无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－Ｇ基因组中，得到两株高效表达ＨＢｓＡｇ基因又形成包涵体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋．对重组病毒的酶切鉴定、ＤＮＡ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，外源基因及其相应的启动子和增强子序列已正确插入病毒基因组中．插入顺序中，ｈｒ５增强子是插入ＨＢｓＡｇ基因下游，多角体基因与ＨＢｓＡｇ基因方向相反．１２５Ⅰ－固相放射免疫检测和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＨＢｓＡｇ基因在昆虫离体细胞中得到高效表达并保留了抗原活性．ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋表达的ＨＢｓＡ吕蛋白与没有插入增强子序列的重组病毒ＴｎＮＰＶ—ＨＢｓ８５－ＯＣＣ＋的比较，分别提高了４０％和４６％．     

高等真菌LMPQ39基因文库的构建

以噬菌体λＥＭＢＬ３ＤＮＡ为载体，用ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ双切酶切后，与Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切的１０－２１ｋｂＤＮＡ片段连接，体外包装，感染Ｅ·ｃｏｌｉＬＥ３９２，所得重组子数为２．２１×１０４ｐｆｕ，超过建库所需的理论值．随机挑选的１４个克隆子，其ＤＮＡ用ＢａｍＨＩ酶切，有９个出现了不同于载体ＤＮＡ的酶切带型．     

小白菜苏云金牙孢杆菌CryIB基因的遗传转化

用限制ＳｐｈＩ和ＥｃｏＲＩ消化质粒ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１和ｐＢＱＸ,将ｐＢＱＸ上的经发行过的苏云金芽直菌杀虫晶体蛋白基因ＣｒｙＩＢ取代ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１上的ＧＵＳ基因,得到一个中间克隆ｐＢＩＷＩＱ－１。用限制酶ＨｉｎｄⅢ消化质粒ｐＢＩＷＩＱ－１,回收含ＣｒｙＩＢ基因的５．１ｋｂＤＮＡ乍段,插入质粒ｐＢＩＮ１９的Ｈｉｎｄ０２８３位点,构建成具卡那霉素抗性的植物表达载体ｐＢＩＷＩＱ－５．ＥＴ     

野油菜黄单胞菌NK－01生物合成黄原胶的分子遗传学分析

本文采用甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变野油菜黄单胞菌ＮＫ－０１得到多糖合成缺陷的不产粘突变株。经ＳａｌＩ部分酶切得到ＮＫ－０１染色体ＤＮＡ片段，将其连接到广泛寄主载体ｐＲＫ２９３上，在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中建立完整的ＮＫ－０１基因文库。在协助质粒ｐＲＫ２０１３存在下，不产多糖突变株分别与含基因文库的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落群进行三亲接合转移，筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体。对接合后体进行重组质粒的酶切分析表明，所克隆的ＤＮＡ具有片段重叠。上述重组质粒对另外９株不产多糖突变株互补检测及遗传学分析表明，１３．４ｋｂ的ＤＮＡ片段含有合成黄原胶所必需的基因。     

t-PA在昆虫细胞中的表达

将含完整阅读框架的人ｔ－ＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ－ｙｔｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ克隆至昆虫细胞表达转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８中,获得重组质粒ｐＢａｃ－ｔＰＡ。应用脂质体共转染法,将ｐＢａｃ－ｔＰＡ和线性化杆状病毒ＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡ共转染Ｔｎ－５Ｂ－１昆虫细胞。经空斑筛选获得１１株重组病毒。经ＰＣＲ鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达ｔ－ＰＡ的重且病毒ＢａｃｔＰ     

红细胞生成素(EPO)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中稳定表达

将ＥＰＯｃＤＮＡ分别插入真核表达质粒载体ｐＳＶ２ｄｈｆｒ和ｐｃＤＮＡ３的适当位点,用电脉冲法导入ＣＨＯ细胞,用ＥＬＩＳＡ法检测ＥＰＯ的表达量,用ＴＦ１细胞检测ＥＰＯ表达产物的生物活性．结果表明,用ｐＳＶ２ｄｈｆｒ作为载体,在抗ＭＴＸ阳性细胞克隆中,获得了表达ＥＰＯ（２５８ｎｇ／ｍＬ培养液）的ＣＨＯ细胞株,并且表达产物具有生物活性．进一步的传代和冻存试验表明,所得细胞株表达ＥＰＯ的水平不受传代和冻存的影响     

大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因在小菜蛾细胞中的表达

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的杆状病毒转移载体．ｐＡｃ３６０－β－ｇａｌ与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－ＰＸ２－ＨＮＵ２,Ｐｘ）,利用Ｘ－ｇａｌ空斑检测分析,β－ｇａｌ基因成功地插入ＡｃＮＰＶ基因组中,得到重组病毒Ａｃ－β－ｇａｌ,重组病毒在Ｐｘ细胞中表达出受ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因启动子控制的具有生物活性的外源基因表达产物──β－ｇａｌ．     

乙型肝炎表面抗原基因DNA介导的体液免疫初步研究

用ＣＰＲ技术从纯化的乙型肝炎病毒核酸中扩增出ｐｅｒＳ２－Ｓ基因,并将其定向克隆于真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中,构建成带有完整的乙肝表面前Ｓ２抗原基因和Ｓ基因的重组质粒。重组质粒经酶切及部分序列分析鉴定后,瞬时转梁小鼠Ｌ细胞,ＥＬＩＳＡ法检测到培养上清液有ＨＢｓＡｇ表达。用纯化的重组质粒静脉、肌肉和皮下注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,首次接种质粒ＤＮＡ３周后,血清抗体开始出现,再次加强２周后,阳性     

旋毛虫排泄分泌抗原p49基因的克隆

应用ＤＮＡ重组技术将编码旋毛虫肌幼虫４９ＫＤａ抗原的基因克隆于大肠杆菌中．设计特异的ＰＣＲ引物,用ＰＴ－ＰＣＲ技术直接从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中反转录并扩增出约１．１Ｋｂ的靶ＤＮＡ．用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶解后将其克隆到质粒载体ｐＵＣ１９中,用Ｘ－ｇａｌ培养基筛选重组子．该重组子经相同的核酸内切酶水解获得约２．７Ｋｂ和１．１Ｋｂ两个片段,分别与ｐＵＣ１９和目的基因的大小相同,目的基因经序列分析并与文献报道的序列比较发现具有９７．８％的同源性．     

小灵猫华东亚种线粒体DNA限制性位点图

提纯了小灵猫华东亚种（ＶｉｖｅｒｒｉｃｕｌａｉｎｄｉｃａｐａｌｉｄａＧｒａｙ）的肝脏ｍｔＤＮＡ．用ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲⅤ、ＨｐａⅠ、ＫｐｎⅠ、ＭｌｕⅠ、ＰｓｔⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳａｃⅡ、ＳａｌⅠ和ＸｈｏⅠ等１１种识别６碱基对的限制性内切酶对小灵猫华东亚种ｍｔＤＮＡ进行消化分析，１１种限制性内切酶均有１～５个位点；根据单酶消化和双酶消化片段的数目和分子量，构建了小灵猫华东亚种ｍｔＤＮＡ限制性位点图     

小鼠4.5S RNA逆转座子cDNA的克隆及其表达载体的构建

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从小鼠肝脏组织总ＲＮＡ中扩增出４．５Ｓ ＲＮＡ的ｃＤＮＡ．此ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以虫荧光素酶基因作了报导基因的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０的ＰｖｕⅡ位点,构建;了４．５Ｓ ＲＮＡ逆转座子的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０－４．５Ｓ,并对４．５Ｓ ＲＮＡ逆转座子的生物学功能进行了研究。