靶向小鼠CREPT基因CRISPR/Cas9敲除质粒的构建

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建靶向小鼠CREPT基因的敲除质粒。方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则靶向小鼠CREPT基因的sgRNAs,与体外转录载体pUC57-sgRNA连接，构建CREPT基因敲除质粒；体外切割实验验证设计的sgRNAs是否具有活性。结果 设计了3条sgRNAs并分别准确插入pUC57-sgRNA载体；体外切割实验结果显示，以上3条sgRNAs均能够介导Cas9蛋白对靶片断进行切割。结论 制备了小鼠CREPT基因敲除质粒和体外转录的sgRNAs,为构建CREPT基因敲除小鼠模型奠定了重要基础。     

光控超小型CRISPR/Cas经AAV载体递送实现对人基因组的高效编辑

CRISRP/Cas系统是目前广为使用的基因编辑工具，而腺相关病毒(AAV)也是目前最安全有效的基因治疗递送载体。为了实现AAV载体介导的CRISRP/Cas基因编辑，各种可装载于AAV载体的基因编辑工具也先后被报道。尽管如此，AAV载体介导的时空特异性基因编辑仍较难实现。为此我们结合光遗传学，将蓝光诱导表达系统、超小型CRISPR/Un1Cas12f1基因编辑系统以及AAV载体递送系统进行有机整合，开发出光控诱导表达的超小型基因编辑系统(AAV-PA-Cas12f1),并将其通过AAV递送至人源细胞HEK293T中。在无光条件下其表达背景极低，而经过蓝光诱导实现了对人基因组的高效基因编辑：以Intergene2为例，利用PCR产物-TA克隆结合单克隆测序分析得到该系统的实际编辑效率高达56%,编辑类型为碱基缺失或兼具碱基缺失与插入。此工具的开发为实现体内精准基因编辑奠定了基础，为解析更多生物学机制及探索疾病治疗策略提供了技术平台。     

利用CRISPR/Cas9系统建立成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型

目的 利用腺相关病毒9(AAV9)介导的CRISPR/Cas9系统构建成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型,来研究内源性OGA在成体心脏稳态维持中的功能。方法 首先,筛选靶向Oga编码区的有效sgRNA,构建包装表达有效sgRNA的AAV9病毒。其次,建立心肌细胞特异性SpCas9表达小鼠(α-MHC^Cas9),并通过腹腔注射方式将AAV9-sgOga注射到小鼠体内。通过qPCR和Western blot印记杂交实验检测Oga的表达情况,确定Oga敲除是否成功。最后,通过组织学分析心脏结构,以及超声心动图分析心脏功能,来分析Oga对心脏稳态维持的影响。结果 筛选到2条可以有效靶向Oga编码区的sgRNA,通过AAV9递送实现了Oga基因在心脏组织的有效敲除,且导致O-GlcNAcylation表达显著上升;组织学分析和超声心动图分析发现基因敲除小鼠心脏结构及功能在基础水平与对照小鼠无显著变化。结论 利用AAV9介导的CRISPR/Cas9系统成功建立了成体心肌细胞Oga基因敲除的小鼠模型,为研究OGA介导的O-GlcNAcylation清除在心脏稳态维持中的功...     

靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用

目的:设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.方法:采用生物信息学网站设计靶向c-myc基因的gRNA,以GFP作为对照设计GFP gRNA;通过T7E1筛选出编辑效率高的gRNA并将筛选的gRNA构建CRISPR/Cas9腺病毒载体并包装腺病毒,通过分析细胞增殖、周期和凋亡及迁移能力的变化来评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.结果:成功设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统能够显著抑制Hepa1-6细胞的增殖和迁移、阻滞细胞周期进程,但对细胞凋亡无影响.结论:靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统可在细胞水平明显抑制肝癌细胞的生长.     

ZFN,TALEN和CRISPR/Cas9在小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的效率比较

哺乳动物黑色素的合成依赖于酪氨酸的氧化作用,而酪氨酸酶(Tyr)是催化酪氨酸氧化反应的关键酶,当外源Tyr基因整合进白毛色小鼠基因组中,会使它获得黑色素合成的能力,表现出与原来不同的毛色表型。为方便、快捷地获得Tyr基因整合的小鼠,构建了一个无启动子的pTyr-2A-DsRed同源重组质粒供体,选择Rosa26的第一个内含子作为外源基因整合的靶位点,设计了切割位点几乎一致的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统。通过流式对比分析C_2C_(12)细胞中红色荧光蛋白DsRed的表达水平,比较了3种基因组编辑工具介导的外源基因定点整合效率,结果发现CRISPR/Cas9的效率最高,在此基础上,利用CRISPR/Cas9将供体整合到小鼠胚胎干细胞中,筛选单细胞克隆进行囊胚腔注射和胚胎移植,获得一只存活的嵌合体小鼠,表现出白毛中夹杂黑毛的表型,表明整合到小鼠Rosa26的Tyr基因可以正常表达。     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

新型基因编辑技术CRISPR/Cas9系统研究现状

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌防御外来噬菌体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统.依据Cas蛋白种类和同源性,CRISPR/Cas系统被分为3类,其中,Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白参与,而Ⅱ类系统,即CRISPR/Cas9组成简单,仅需Cas9蛋白参与即可.经过遗传工程改造后的CRISPR/Cas9已经作为一种新型的基因编辑工具被用于多种生物的基因组编辑.本文就CRISPR/Cas9系统的发现、结构组成、作用机制、研究现状、面临的困境及应用前景等几方面进行了总结.     

gRNA二级结构对拟南芥HD2基因CRISPR/Cas9编辑率的影响

近年来,利用基因编辑工具编辑特定基因逐渐成为一种获得突变体的主要方法。CRISPR/Cas9编辑技术是目前最新和最高效的基因编辑技术。然而,这一技术在植物中的编辑率受到很多因素的影响,例如如何设计gRNA以及如何避免脱靶效应等。为了探究gRNA的二级结构对拟南芥基因编辑的影响,我们选择了拟南芥基因组中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族中一个植物特有的亚家族(HD2)为靶基因,通过设计这一亚家族中3个HD2基因不同的CRISPR/Cas9靶点,观察不同gRNA接头二级结构对CIRSPR/Cas9编辑率的影响。结果显示：不同gRNA接头二级结构对基因的编辑率会有一定的影响,当二级结构由一段单链RNA、5个茎环、2个突环和3个发夹环组成的时候,编辑率最高。该研究可为后续人们使用以tRNA为策略设计gRNA的CRISPR/Cas9工具时选择合适的靶点,为提高基因编辑率提供基础。     

心血管疾病的基因治疗

基因治疗在先天遗传性以及后天获得性心血管疾病治疗中均具有广阔的发展前景. 对心血管疾病致病机理的深入认识和疾病基因组学研究的发展, 进一步促进了临床前基因治疗的研究进展. 但基因治疗过程中存在的机体细胞免疫反应、外源基因表达水平不足、在体基因转导效率低下等因素都成为基因治疗临床应用转化的瓶颈. 近年来, 基因导入载体和基因组编辑技术的发展为上述问题的改善和解决提供了新的思路. 目前成族规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas9 基因组编辑技术已经成功应用于动物模型的在体基因编辑, 达到了显著改善血脂指标的疗效. 进一步研究体内组织特异和高效的基因导入方式, 提高基因编辑的靶向效率和特异性, 并建立全面有效的安全评估实验体系, 将推动基因治疗向临床应用的转化. 针对心血管疾病基因治疗中基因导入载体的研究以及CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的应用展开讨论.     

水稻中5个FT-Like家族成员的基因编辑突变体的创建与分析

为了揭示水稻中FT-like亚家族成员的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术对其中的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11进行基因编辑.在5个基因的编码区各选择1个靶点构建1个融合的sgRNA表达框,将表达框装载到CRISPR/Cas9表达载体中,通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻...     

高效切割Hipp11 敲入位点的sgRNA 设计及活性验证

摘要: 目的设计并验证能够高效切割Hipp11 位点的sgRNA,为在Hipp11 位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11 位点的sgRNA 进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9 活性检测试剂盒在体外检测sgRNA 的活性。选取活性较高的sgRNA 体外转录,与Cas9 mRNA 一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11 位点切割效率,计算出sgRNA 的体内活性。结果两个sgRNA 的体外活性分别为19. 2%和51. 7%,使用体外活性高的2 号sgRNA 显微注射获得8 只新生小鼠,其中62. 5% ( 5 /8) 的小鼠中检测到Hipp11 位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11 位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR 技术在Hipp11 位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA 体外活性能够预测sgRNA 在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA 的有效手段。     

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD 载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测，本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统，根据PPARD基因结构和序列特点，设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列，将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞，提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后，通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白，利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现，PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比，PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体，并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑，将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率，推进对PPARD基因的功能研究。     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了...     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.     

CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼park2基因的定点敲除

作为目前最新、最先进的基因编辑技术,CRISPR/Cas9系统为分子细胞生物学带来革命性发展,以它的简单高效、灵活性以及可实现DNA序列的定向突变而被广泛使用.斑马鱼的park2基因位于第13号染色体上,编码的Parkin蛋白是一个E3泛素连接酶.该基因在斑马鱼中的功能还不清楚.利用CRISPR/Cas9系统,首次在斑马鱼胚胎中实现了park2基因的大片段删除.由于斑马鱼在发育和疾病研究中有很大优势,实现park2基因敲除将有助于将来进一步研究该基因的功能.     

RNA靶向基因组编辑技术CRISPR/Cas9在昆虫中的研究进展

介绍CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制、脱靶效应以及在昆虫基因编辑和基因功能研究中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行展望,为进一步将该技术应用于非模式昆虫的基因编辑和基因功能研究提供参考.     

一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法

利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体.     

基因组编辑技术——CRISPR/Cas系统

基因定点编辑技术包括基于胚胎干细胞及同源基因片段重组的基因打靶技术、锌指结构(ZFN)、类转录激活因子效应物(TALEN)以及CRISPR/Cas系统,CRISPR/Cas系统具有操作简单、突变率高、成本低,同时可针对多个基因等优点;该技术可进行定点修饰,如敲除、插入、替换等.目前CRISPR/Cas系统已成功应用到小鼠、人类细胞、线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和猴等.文章将对基因修饰技术发展脉络做统一梳理,并将系统阐述CRISPR/Cas系统的原理、应用以及该技术的优缺点.     

张锋团队发布CRISPR全新诊断系统

<正>美国博德研究所张锋团队在近日出版的《科学》杂志上发表论文称,他们用另一种剪切酶Cas13a取代CRISPR/Cas9中的Cas9,将原本靶向DNA(脱氧核糖核酸)的基因编辑工具延伸为靶向RNA(核糖核酸)的全新诊断系统,灵敏度甚至高到能检测出单个目标核酸分子,有望给基础研究、传染病诊断治疗等带来革命性影响。2016年6月,张锋和同事首次发表论文称,CRISPR/Cas13a能精确剪切细菌细胞中的特定RNA序列。但与Cas9