Mutator转座子介导的玉米插入突变体库的构建及遗传评价

以Q105, WW51, 115F, V26-2, 919J为Mutator转座子供体材料, 与本地优良玉米自交系受体材料Hz85, W328以及S-Mo17^Rf3Rf3杂交, 获得26718单株的插入诱变F₁群体(M1). 田间鉴定M1单株的生物学特征及农艺学性状的表型突变, 室内考察突变单株自交果穗M2籽粒性状的突变类型, 并以斑点籽粒出现的频率评价Mu因子的转座频率. 结果表明, 在所构建的Mu介导的玉米插入突变体库中, 以W328为母本(BzBz)的M1群体平均田间表型突变频率为0.07; 以W328 × Mu的M2果穗斑点籽粒的出现频率评价的Mu转座频率为0.121802; 在22500个S-Mo17^Rf3Rf3 × Mu单株中, 发现了5个S型玉米细胞质雄性不育突变单株, 突变频率为2.2×10^-4. 利用优化的MuTAIL-PCR技术分析了99条转座子插入位点的侧翼序列, 归并整理后获得59条(每条约400核苷酸序列)非重复靶位点序列. 对59条序列非重复的Mu因子插入产生的9 bp靶位点正向重复序列进行同源性比较分析, 结果表明, Mu的插入有序列热点. 经生物信息学分析后注释了27条与玉米、水稻等植物核苷酸数据库中匹配值较高的功能序列. 利用比较基因组学方法将36条单一基因序列定位在玉米遗传图谱上, 有多条Mu插入靶位点序列定位在单个标记位点上. 分析发现, 8条Mu插入靶位点序列的预测功能与其相应的定位标记的功能具有一致性. Mu插入突变体库的构建与遗传评价为利用Mu转座子进一步发掘玉米基因、深入开展玉米功能基因组学研究搭建起重要的技术与材料平台.     

水稻稀穗突变体的遗传分析及基因的精细定位

水稻稀穗突变体lax影响花序发育的主要特征是: 穗轴上能形成正常的一次、二次枝梗, 侧生小穗的发育被完全阻断, 只在枝梗的顶端发育形成单个小穗, 且小花呈多种异常变异. 突变体与粳稻品种W11杂交获得F₂分离群体. 以该F₂分离群体为基础, 根据水稻基因组序列设计微卫星引物和CAPS标记, 并进行连锁分析, 将稀穗基因定位在水稻第1染色体长臂的CAPS标记HB2和微卫星标记MRG4389之间, 与两标记间的距离均为0.14 cM, 与CAPS标记LZ1共分离. RT-PCR分析结果显示, 在稀穗突变体中与花器官发育相关的B功能基因OsMADS2, OsMADS4, OsMADS16 以及C功能基因OsMADS3的转录水平明显下降, 而A功能基因 RAP1A的转录水平未受到影响.     

水稻早衰叶突变体基因psl1的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官. 作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关. 利用水稻中花11号经Co⁶⁰辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F₁及其衍生的F₂群体, 对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该早衰叶突变体是由一隐性核基因psl1控制, 利用SSR标记把psl1定位在水稻第2染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在该基因附近区域发展了34对新的STS标记, 对psl1进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖psl1区域的BAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约48 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

一个新的水稻卷叶突变体rl9(t)的遗传分析和基因定位

对水稻中调控形态发育的基因进行发掘和研究是进行水稻株型改良和植物生长发育分子生物学研究的重要基础研究工作. 本研究在粳稻中花11中鉴别了一个新的卷叶突变体, 并对其进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该卷叶突变体是由一隐性单位点(rl_9(t))控制, 利用SSR标记已经把Rl_9(t)定位在水稻第9染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在Rl_9(t)附近区域发展了30个新的STS标记, 对Rl_9(t)进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖Rl_9(t)区域的PAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约42 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

水稻散生突变体的遗传和基因定位研究

分蘖角度是构成水稻理想株型和高产育种的重要农艺性状之一. 通过对水稻散生突变体的遗传学分析认为, 该散生表型受一隐性核基因控制, 与已报道的水稻散生突变体la等位, 故将此突变体命名为la-2, 而原突变体被重新命名为la-1. 利用la-2与w11和浙福802分别杂交产生的F₂群体对LA位点进行遗传定位, 发现其与第11号染色体上的微卫星标记RM202和RM229连锁, 遗传距离分别为10.0和8.0 cM. 通过进一步在两标记间发展的6个新的分子标记, 将该基因精确地定位于约0.4 cM的区间. 为进一步克隆LA基因和探讨水稻分蘖角度的控制机制奠定了良好的基础.     

衣藻细胞色素b559 α 亚基Ser24残基定点突变影响PSⅡ光合放氧活性

为研究细胞色素b₅₅₉ (Cyt b₅₅₉)在光合系统中的功能, 采用大引物定点突变技术, 将衣藻叶绿体Cyt b₅₅₉ α亚基(psbE基因编码)中与组氨酸(His²³)相邻的氨基酸残基丝氨酸(Ser²⁴)定点突变为苯丙氨酸(Phe), 获得突变体S24F. 对突变体的生理生化分析表明, S24F既能进行光合自养也能进行光合异养, 但是在自养和异养条件下, 其生长速率比对照慢; S24F的PSⅡ放氧活性约为野生衣藻细胞的71%, S24F的光系统Ⅱ(PSⅡ)光化学效率F_v/F_m比野生型对照低约0.23. 此外, 相比野生型对照, 突变体S24F对强光更加敏感; SDS-PAGE和Western杂交的结果表明, 对Cyt b₅₅₉ α亚基中Ser²⁴的定点突变影响了Cyt b₅₅₉ α亚基及其他膜蛋白, 如LHCⅡ和PsbO等的表达. 上述结果说明, 虽然Ser²⁴残基并不参与血红素配位, 但其对维持PSⅡ的活性具有重要作用.     

利用C基因组C0t-1 DNA比较分析稻属A, B, C, D基因组

以药用野生稻(CC) C₀t-1 DNA作为探针, 对其自身体细胞染色体和栽培稻×药用野生稻杂交后代F1, 回交后代BC₁以及宽叶野生稻(CCDD), 高秆野生稻(CCDD)和斑点野生稻(BBCC)体细胞染色体进行荧光原位杂交实验. 在药用野生稻体细胞染色体中, 同源染色体呈现相似的C₀t-1 DNA杂交带型, 并对其核型进行了同源性聚类. 对F₁ (AC)和2个BC₁ (AAC和ACC)的杂交实验中, 在不封阻的情况下, 药用野生稻C基因组C₀t-1 DNA探针能清晰地鉴别C组染色体, 而在A组染色体上信号分布很少, 说明A基因组与药用野生稻C基因组中高度重复序列同源性较低. 此外, 对宽叶野生稻、高杆野生稻和斑点野生稻3个四倍体体细胞染色体进行了FISH分析, 在24条C组染色体上均可观察到较强的杂交信号, B和D基因组的24条染色体上信号较少, 但在D组染色体上的信号较B组染色体的多, 说明D与C基因组的亲缘关系较B与C基因组的近. 进一步分析发现, 高杆野生稻D组染色体上的杂交信号要比宽叶野生稻D组染色体上的杂交信号多, 说明高杆野生稻的D基因组与C基因组的同源性要高, 这可能是高秆野生稻和宽叶野生稻同属于CCDD染色体组型但可区分为不同种的原因之一. 上述结果表明, C₀t-1 DNA具有很强的种的特异性和依赖基因组型的特异性, 利用C₀t-1 DNA作探针更能有效地对不同基因组进行FISH鉴定. 同时, 本研究采用F₁植株和BC₁植株, 即1个二倍体和2个三倍体人工选育杂种, 与宽叶野生稻、高杆野生稻和斑点野生稻进行了基于C基因组C₀t-1 DNA杂交的比较分析, 对稻属异源四倍体的可能起源机制进行了初步探讨.     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因. 利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合, 构建了含4892个单株的F₂定位群体. 同时, 利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库, 构建了一个覆盖目标基因位点的长约213 kb的跨叠克隆群. 根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列, 以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序, 设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位. xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离, 标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM, 物理距离约为24 kb. 对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测, 揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因. 对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

水稻幼穗分化受阻突变体lhd的遗传分析与基因定位

从圭630/台湾粳的F₁花药培养后代群体中发现了水稻幼穗分化受阻突变体lhd(leafy head), 其植株明显矮化, 叶片细小且丛生, 始终停留在营养生长阶段. 遗传分析表明, lhd受一对隐性基因控制, 该突变基因拟命名为lhd (t). 显然, LHD(t)是控制花序分化的关键基因. 以lhd杂合体与明恢77和京花8号杂交, 建立了2个F₂群体. 在与京花8号杂交的F₂群体中, 部分lhd植株表现出“中间类型”, 说明遗传背景会影响突变性状的表现. 利用已公布的水稻RM系列SSR标记及自行设计的SSR标记, 结合BSA和突变株(共498株)分析, 将LHD(t)基因定位在第10染色体长臂端, 其中标记SSR1, RM269, RM258, RM304和RM171位于一侧, 与LHD(t)的图距分别为6.4, 16.6, 18.4, 22.2和26.3 cM; SSR4和SSR5位于另一侧, 与LHD(t)的图距分别为0.6和2.2 cM. 该结果为进一步对LHD(t)的克隆和表达研究奠定了基础.     

利用鳞翅目来源的转座子piggyBac建立高效稳定的转基因家蚕技术

piggyBac转座子元件被成功应用于家蚕转基因. EGFP荧光蛋白基因作为筛选标志, 受含有Pax-6结合位点的启动子控制, 并能在家蚕的眼部组织中特异性表达. 荧光筛选质粒和piggyBac转座子表达质粒被以混合物的形式显微注射到家蚕受精卵, 获得出生的G₀代蛾子700个, 互相交配后, 利用EGFP荧光筛选获得111个独立的转基因系. 大部分转基因系在基因组上携有2个或多个插入拷贝, 并且在整个项目过程中转基因的表型稳定遗传6代以上. 对插入位点的序列鉴定发现, 其插入位点两侧具有特异性TTAA序列, 证实转基因的插入受到piggyBac转座子的调控. 高效稳定的家蚕转基因技术的建立为家蚕后基因组的研究和蚕业工业的发展提供了基础.     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析

为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理, 应用自杀性质粒pZJ25, 将Tn5转座到B8的染色体上, 筛选到2株拮抗活性丧失的菌株. 选择其中B8F突变株, 应用Tn5上的Kan^r基因作为标签, 对Tn5插入位点右侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆, 筛选得到质粒pTLF, 经亚克隆后测序, 获得F片段735 bp的序列. 提取原始菌株B8基因组DNA, 酶切后与PstⅠ接头连接, 应用接头引物和根据F片段设计的特异引物, 在F片段的左右两侧进行染色体步行, 获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的1106 bp序列和F片段右侧的664 bp序列. 生物信息学分析显示, 获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF, 与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(基因GenBank登录号AY192157)有较高的同源性, 分别对应于admM, admN和admO共3个基因. 被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF基因)对应于admM (Polyketide 合酶基因), 插入位点位于终止密码前214 bp处. 由此证明, anrF基因与B8菌株的拮抗活性相关, 推测B8菌株产生的拮抗物质为andrimid.     

水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.     

水稻不完全隐性卷叶主基因rl(t)的精细定位

利用奇妙香(QMX)为轮回亲本, 与卷叶珍汕97B(JZB)杂交并回交的BC₄F₂和BC₄F₃两群体为研究材料, 对卷叶性状进行了遗传分析, 并对卷叶基因进行精细定位. 遗传分析表明, 卷叶性状主要受1对不完全隐性主基因的控制, 命名为rl_(t), 并同时受到数量性状基因和或环境的影响. 利用500个SSR标记和新开发的15个InDel标记, 通过BSA法在卷叶DNA池和平展叶DNA池间筛选到8个多态性标记, 并用MAPMAKER/EXP3.0构建遗传连锁图. 基因定位方法采用复合区间作图法(CIM). 利用BC₄F₂分离群体将rl_(t)初步定位于第2染色体长臂, 位于标记InDel 112~RM3763之间, 两标记之间的遗传距离为2.4 cM, rl_(t)距离InDel 112约1.0 cM. 为精细定位rl_(t), 从BC₄F₂代经标记选择得到1个中度卷叶植株, 自交扩繁成855株个体的BC₄F₃代株系, 另发展4个新的InDel标记. 连锁分析表明, InDel 112.6和InDel 113位于标记InDel 112和RM 3763之间. 利用BC4F3株系中分离出的191个卷叶株和185个平展叶株, 将rl_(t)定位于InDel 112.6~InDel 113之间, 物理距离为137 kb. 对该区段进行了初步的侯选基因分析, 推测rl_(t)可能参与了microRNA(miRNA)系统对叶片发育的调控.     

水稻穗部突变体Cl的形态和定位分析

簇生穗突变体Cl表型为多数枝梗顶端有2或3个小穗簇生在一起. 利用扫描电子显微镜观察显示, Cl的功能与水稻枝梗顶部的发育有关, 同时Cl影响了顶端小穗的伸长; 而Cl突变体中穗粒数有一定降低, 提示Cl基因可能对水稻穗粒数也有一定的影响. 分别利用Cl与中花11及Cl与浙辐802 杂交的F₂群体对Cl位点进行遗传定位, Cl位点初步定位在第6染色体的CAPS标记CK0214和SS0324之间. 为了进一步精细定位Cl位点, 在CK0214和SS0324之间发展了5个CAPS标记, 连锁分析表明, Cl与其中2个标记R0674E和C12560紧密连锁, 遗传距离分别为0.2和2.1 cM, 并且Cl被定位在这两个标记之间. 以此为起点, 构建覆盖Cl基因区域的PAC 重叠群, 两个PAC克隆AP004571和AP004236将Cl位点覆盖, 物理距离为196 kb, 为最终克隆Cl基因奠定了基础. 等位性测定显示, Cl与另一个水稻簇生穗突变体Cl2是等位突变.     

ENU诱变获得4种白斑小鼠及对突变基因的染色体定位

“表型驱动法”是通过诱变、定位及克隆突变基因来研究基因功能的一种手段. 以ENU处理C57BL/6J(B6)雄鼠150只, 繁殖后代小鼠3860只, 筛查到有突变表型的小鼠210只, 经传代实验得到能够遗传的突变鼠10余种, 其中4种为呈显性遗传的白斑突变, 它们是Wbct, W^−1Bao, W^−2Bao和W^−3Bao, 共同表现为腹部、四肢末端及尾部的局部白化. 为定位这些突变基因, 选择平均分布于小鼠基因组且在B6与DBA/2J(D2)间有差异的微卫星标记39个, 区分(B6×D2)×D2的F₂代有无白斑表型后, 用39个微卫星进行基因组扫描. 结果表明, W^−1Bao突变基因与D5Mit168的LOD值为0.56, 与D5Mit352的LOD值为4.47. 在此基础上, 逐步选择接近突变基因的微卫星D5Mit290, D5Mit312, D5Mit356及D5Mit308, 扩大F₂的数量至537只, 将W^−1Bao突变基因定位在第5号染色体D5Mit356及D5Mit308之间, 距着丝粒约42.19 cM; 同理, 将W^−2Bao及W^−3Bao突变基因也定位在与W^−1Bao相近的区域, Wbct突变基因定位于第1号染色体距着丝粒约41.6 cM处. 经过检索小鼠基因组数据库和对染色体局部基因的逐个分析, 认为kit基因为W^−1Bao, W^−2Bao及W^−3Bao白斑突变的候选基因.     

13个水稻WRKY基因的克隆及其表达谱分析

转录调控因子WRKY蛋白拥有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和Cys₂His₂或Cys₂HisCys锌指型结构. 利用WRKY蛋白质的保守结构域, 搜索了整个水稻基因组编码WRKY蛋白质的基因, 鉴定了97个WRKY基因, 并从4℃胁迫的水稻植株cDNA文库中获得13个WRKY基因全长cDNA克隆. Northern blotting分析结果显示, 其中10个WRKY基因的表达受到NaCl, PEG, 低温(4℃)和高温(42℃)等4种非生物逆境因子胁迫的影响, 但其诱导表达模式不论在逆境因子种类还是在诱导时间上均存在着很大的差异, 这种基因诱导表达模式的差异可能体现于它们之间的生物学功能的差异.     

西藏喜马拉雅冷杉年轮δ 13C与气候意义

对采自青藏高原东南部林芝地区的喜马拉雅冷杉进行交叉定年后, 分析了喜马拉雅冷杉年轮 δ ¹³C序列与气候要素之间的关系. 去除大气CO₂浓度升高导致大气CO₂中δ ¹³C下降和生长趋势的影响后, 建立树轮δ ¹³C值的残差序列Δ¹³C. 利用附近林芝气象站的气象资料, 分析了树轮Δ^{13C序列对气候要素的响应. 结果表明: 冷杉δ 13C的高频振荡与该地区前一年的9～11月降水和相对湿度存在较好的相关性, 并存在强的滞后效应. 通过建立回归方程重建了该区域的秋季(9～11)月相对湿度序列, 解释方差达37.9%. 重建相对湿度序列表明1800年前相对湿度变化周期较短、变幅较小, 1800～2000年则相反.}     

Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产H₂的主要副产物, 每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了H₂的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据adhE基因保守序列框克隆K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%, 乙醇产量下降了70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.     

高粱C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的分子克隆及其转基因水稻的培育

应用PCR的方法从C4植物高粱的基因组中分离出C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ppc基因). 通过分步克隆的方法, 将此基因插入pCAMBIA1301质粒载体上, 构成重组的表达载体p1301-PEPC, 并利用农杆菌介导的转化系统将其转入农垦58和中花10两个粳稻品种. 经PCR分析、PEPCase活性检测、Western杂交、Northern杂交和Southern杂交等多种方法鉴定表明, C4型Ppc基因已转化进受体水稻植株的核基因组, 并能高水平表达. 生理学检测显示, 转基因水稻植株的CO₂补偿点和光呼吸速率显著降低, 光饱和光合速率和羧化效率提高, 显示出C4植物的光合特征.     

T-DNA插入稻瘟病菌Gγ亚基基因启动子的突变体A1-412丧失形成附着胞、穿透和致病能力

用TAIL-PCR的方法获得了A1-412突变体的T-DNA侧翼基因组序列, 测序结果表明, 外源T-DNA插入到稻瘟病菌G蛋白γ亚基基因MGG1 (Magnaporthe grisea G protein Gamma亚基)的启动子区域. MGG1编码93个氨基酸, 具有典型的G蛋白γ亚基结构域(GGL)和C末端CAAX框, 并与其他丝状真菌G蛋白γ亚基有较高的一致性. 外加cAMP能诱导部分A1-412分生孢子形成附着胞, 但这些附着胞的形态不正常, 不能穿透洋葱内表皮或水稻叶片. 另外, A1-412与相对应交配型的菌株杂交时几乎不产生子囊壳. 将MGG1基因重新导入A1-412突变体可部分恢复上述表型. 这些结果表明, G蛋白γ亚基MGG1可能涉及稻瘟病菌形态分化、有性生殖、致病性等方面的调节作用.