不同倍性鲤科鱼Cyclin B基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼Cyclin B基因部分DNA序列.结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼cyclin B基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类cyclin B基因DNA片段序列进行比较分析.结果表明:由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750 bp,950 bp,720 bp和720 bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段(1200 bp和900 bp),三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段(1200 bp,900 bp和750 bp),每个DNA片段均含Cyclin B基因第2,3内含子和第2,3,4外显子.序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200 bp片段同源性分别为99.5%,98.9%,99.5%和88.7%,与母本900 bp片段同源性分别为97.5%,94.6%,94.2%和89.9%,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200 bp和900 bpCyclin B基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性.而三倍体和五倍体鲫鲂的750 bp Cyclin B基因片段与父本同源性分别高达98.6%和98.2%,说明其来自父本团头鲂.在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本Cyclin B基因片段序列消除现象.此外,用Cyclin B基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由Cyclin B基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析.     

不同倍性鲤科鱼CyclinB基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼CyclinB基因部分DNA序列．结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼CyclinB基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类CyclinB基因DNA片段序列进行比较分析．结果表明：由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750bp,950bp,720bp和720bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段（1200bp和900bp）,三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段（1200bp,900bp和750bp）,每个DNA片段均含CyclinB基因第2,3内含子和第2,3,4外显子．序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200bp片段同源性分别为99．5％,98．9％,99．5％和88．7％,与母本900bp片段同源性分别为97．5％,94．6％,94．2％和89．99／6,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200bp和900bpCyclinB基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性．而三倍体和五倍体鲫鲂的750bpCyclinB基因片段-9父本同源性分别高达98．6％和98．2％,说明其来自父本团头鲂．在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本CyclinB基因片段序列消除现象．此外,用CyclinB基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由CyclinB基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析．     

利用ATPase基因研究杂交多倍体鲫鲂线粒体母性遗传

三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂是通过红鲫旱×团头鲂舍亚科间远缘杂交形成的．采用PCR产物直接测序法,测定了5尾三倍体鲫鲂、6尾四倍体鲫鲂和6尾五倍体鲫鲂及其1尾父本团头鲂的线粒体DNA ATPase8和ATPase6基因的全序列,并与所获得的红鲫和外群斑马鱼的同源序列进行比较,同时分析了其碱基组成、变异情况以及核苷酸和氨基酸序列差异．红鲫、团头鲂、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂之间的序列分歧率为0．0％-21．6％,它们与外群斑马鱼之间的序列分歧率为27．0％-28．2％．用MEGA3．1软件中的Maximum parsimony（MP）,Minimum evolution（ME）,Neighbor joining（NJ）和UPGMA程序构建的分子系统树具有相似的拓扑结构．结果表明,人工杂交三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂在线粒体ATPase8和ATPase6基因上具有严格的母性遗传特征．研究证明ATPase8和ATPase6基因是杂交多倍体鲫鲂遗传变异研究的一个很好的分子标记．     

人工四倍体鲤鲫的产生

在人工诱导的复合三倍体鲤鱼成熟个体中有极个别个体产出的卵既保留了原有的３套染色体,又能与一套外来精核融合产生四倍体。１９９７年人工产生的８０００多尾鲤鲫四位体鱼经细胞遗传学研究分析鉴定,结果所有的个体都有４套染色体组,染色体数目在１８５￣２１０之间,众数为２００,四位体比率为１００％,这表明人工复合三倍体鲤鱼的生殖方式十分独特,绝大部分个体的成熟卵可借助于外来精子的流动进行自然雌核发育;而有极个别     

具有天然雌核发育特性的人工复合三倍体锂鱼

报道了人工诱导的复合三倍体锂鱼的雌性个体的卵细胞可以发育成熟，且具有天然雌核发育特性，人工复合三倍体鲤鱼的雌核发育后仍具有３套完整的亲本染色体，形态不发生分离。     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACEPCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因（HMGj）mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸．不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明：在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性（99％）高于同父本团头鲂的同源性（97%）;三倍体鲫鲂与父母本同源性（95％）低于亲本之间的同源性（98％）;在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性（100％）高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性（97％）．结果表明：远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础．生物信息学分析表明：HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾．这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生“蛋白-DNA”的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成．另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMGl原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制．     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACE PCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因(HMG1)mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸.不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明:在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性(99%)高于同父本团头鲂的同源性(97%);三倍体鲫鲂与父母本同源性(95%)低于亲本之间的同源性(98%);在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性(100%)高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性(97%).结果表明:远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础.生物信息学分析表明:HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾.这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生"蛋白-DNA"的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成.另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMG1原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制.     

磁化水对团头鲂卵巢相关物质的影响

运用多种生化方法测定了磁化水组与对照组团头鲂血液、肝脏中与性腺发育有关的生化成份,包括血清蛋白成分、血清钙、磷含量,肝脏糖原、粗脂肪、RNA 含量。据所测数据,比较磁化水组与对照组雌鱼的差异及各组中雌雄鱼间的差异,以进一步证实两组雌鱼卵巢发育是否处同一时期.结果表明:磁化水对雌性团头鲂早期性腺发育无显著影响。     

新型三倍体鲫鱼—红鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂)

四倍体鲫鲤与二倍体红鲫交配形成了新型三倍体鲫鱼，该三倍体鲫鱼的体侧扁，近似纺锤形，体色为青灰色，无口须.它们的大部分可量比例性状和可数性状都介于父母本之间，并且一些可量比例性状超出亲本范围，体现出杂种特征.第一年养殖结果表明，把同规格三倍体鲫鱼和二倍体红鲫混养，三倍体鲫鱼生长速度比红鲫快11.11%.性腺观察结果表明三倍体鱼的性腺发育比普通二倍体鱼明显滞后，生殖细胞呈退化现象.与以前用四倍体鲫鲤和日本白鲫交配形成的三倍体湘云鲫相比，三倍体鲫鱼不但保持了生长速度快、不育的特点，而且表现出完全没有口须的鲫鱼类型的特征，这在细胞遗传和鱼类育种方面都具有重要意义.     

青鲫（♀）×兴国红鲤（♂）杂交F1代染色体数目及组型分析

采用肾细胞染色体直接制片法及Levan提出的标准，对青鲫（♀）×兴国红鲤（♂）杂交F1代染色体数目及组型分析表明：此杂交F1代鱼的肾细胞染色体数目为150条．染色体组型按着丝点位置可分为四组，其中中部着丝粒染色体9条，亚中部着丝粒染色体15条，亚端部着丝粒染色体78条，端部着丝粒染色体48条．每个染色体小组均由3条同源染色体组成，表明此杂交鱼为三倍体，核型公式为3n=9m＋15sm＋78st＋48t．臂数NF=174．     

异精激发彭泽鲫雌核发育后代染色体组型的研究

利用活体注射ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ植物血球凝集素）法对彭泽鲫及彭泽鲫在不同外源精子刺激形成的子一代进行染色体组型分析，结果表明：彭泽鲫具１６６条染色体，核型组成是１８对中部（ｍ），１７对亚中部（ｓｍ），６对亚端部（ｓｔ），４２对端部（ｔ）着丝点染色体．臂数（ＮＦ）为２３６．说明彭泽鲫是行雌核发育的．本研究结果与其它雌核发育类型的鲫鱼有明显的差别．     

高背型银鲫的一些性状研究

本文对从黑龙江引进的行雌核发育的高背型银鲫和通过以这种银鲫为母本(♀)、鲤鱼为父本(♂)在南京地区进行人工繁殖产生的子代的染色体数、血清蛋白、LDH同工酶及形态性状的分析比较,认为这种鱼具有性状遗传较稳定、适应环境的能力较强等优点,有可能在南京地区进行驯化、培育和推广。     

异精雌核发育淇鲫胚胎发育过程中同工酶分析

分别用同源和异源精子激发的雌核发育淇鲫的12个发育时期的胚胎为材料,采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳技术,对其5种同工酶(EST、LDH、MDH、ME和POD)的表达情况进行了比较分析.结果表明:在胚胎发育过程中,同源精子组和异源精子组胚胎的ME和EST同工酶表达无差异,LDH,MDH和POD同工酶表达存在显著差异.本文认为雌核发育淇鲫存在"异精生物学效应".     

青鲫(♀)×兴国红鲤(♂)杂交F1代染色体数目及组型分析

采用肾细胞染色体直接制片法及Levan提出的标准,对青鲫(♀)×兴国红鲤(♂)杂交F1代染色体数目及组型分析表明:此杂交F1代鱼的肾细胞染色体数目为150条.染色体组型按着丝点位置可分为四组,其中中部着丝粒染色体9条,亚中部着丝粒染色体15条,亚端部着丝粒染色体78条,端部着丝粒染色体48条.每个染色体小组均由3条同源染色体组成,表明此杂交鱼为三倍体,核型公式为3n=9m 15sm 78st 48t.臂数NF=174.     

洞庭青鲫和洞庭青鲫(♀)×兴国红鲤()杂交F_1代的RAPD分析

以鱼的尾鳍为材料,采用苯酚—氯仿法提取鱼的基因组DNA.对提取的结果进行紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳方法的鉴定,筛选出浓度、纯度好的DNA样品进行进一步的RAPD扩增.采用上海生化工程有限公司的80个引物对洞庭青鲫和洞庭青鲫(♀)×兴国红鲤(♂)杂交F1代(简称“杂交鱼”)进行RAPD分析,筛选出9个引物对洞庭青鲫和杂交鱼进行了遗传多样性分析,这9个引物共检出洞庭青鲫89个位点、杂交鱼82个位点.其中多态性位点数:洞庭青鲫76个,杂交鱼71个分别占其总位点数的85.39%、86.58%.据RAPDdataanalyzer1.3v.exe数据分析程序计算,洞庭青鲫平均遗传相似度为0.6537;杂交鱼的平均遗传相似度为0.6218;两种群间的为0.5505.上述两项指标的初步分析表明,这两种鱼具有较为丰富的遗传多样性.     

异源四倍体鲫鲤群体的形成及四倍体化在脊椎动物进化中的作用

对雌雄两性能育并形成群体的异源四倍体鲫鲤的染色体数目和组型,DNA含量,红细胞大小,生殖腺和配子,胚胎发育,形成机理,外形等方面进行了较全面描述。四倍体鲫鲤经过九代（F3-F11）的四倍体性的繁殖,已形成了一个数目庞大的遗传性状稳定的群体。该四倍体群体在染色体数目、生殖、外形特征等方面都与它们的原始父母本-二倍体湘江野鲤和红鲫有本质的差别。在遗传特性、稳定传代、生育隔离等方面,异源四倍体鲫鲤群体为形成一个新的四倍体新种奠定了基础。新的四倍体鱼群体的形成对脊椎动物的进化理论和它们在生产上的应用都具有重要的意义。     

洞庭青鲫和洞庭青鲫(?)×兴国红鲤(?)杂交F1代的RAPD分析

以鱼的尾鳍为材料,采用苯酚-氯仿法提取鱼的基因组DNA.对提取的结果进行紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳方法的鉴定,筛选出浓度、纯度好的DNA样品进行进一步的RAPD扩增.采用上海生化工程有限公司的80个引物对洞庭青鲫和洞庭青鲫(?)×兴国红鲤(?)杂交F1代(简称"杂交鱼")进行RAPD分析,筛选出9个引物对洞庭青鲫和杂交鱼进行了遗传多样性分析,这9个引物共检出洞庭青鲫89个位点、杂交鱼82个位点.其中多态性位点数:洞庭青鲫76个,杂交鱼71个分别占其总位点数的85.39%、86.58%.据RAPD data analyzer 1.3v.exe ＜RAPD data analyzer v1.3.xls>数据分析程序计算,洞庭青鲫平均遗传相似度为0.653 7;杂交鱼的平均遗传相似度为0.621 8;两种群间的为0.550 5.上述两项指标的初步分析表明,这两种鱼具有较为丰富的遗传多样性.     

彭泽鲫繁殖特性的研究

用水平式淀粉凝胶电脉法,分析了5组47尾实验鱼的肌肉和肝脏的4种同工酶,研究了彭泽鲫的繁殖特性,结果表明：彭泽鲫（♀）与彭泽鲫（♂）的子代、彭泽鲫（♀）与鲤鱼（♂）的子代的同工酶电泳图谱与母本完全相同,不含有来自于父本的遗传物质,可以认为彭泽鲫是行雌核发育的种群,子代应是与母本的遗传组成完全相同的克隆。     

大鳍鳠成鱼静止代谢率的初步研究

于2001年6月至2001年7月,采用封闭式呼吸仪,在27.5℃水温下测定了24尾采集于嘉陵江的大鳍鳠成鱼(体质量范围为52.5～149.6 g)的静止代谢率,其中雄鱼11尾,平均体质量(93.8士7.8)g;性腺发育到Ⅱ和Ⅲ期的雌鱼8尾,平均体质量(80.2±7.8)g;性腺发育到Ⅳ期雌鱼5尾,平均体质量(115.6±6.6)g.大鳍鳠静止代谢率与性腺成熟系数相关不显著,与体质量显著相关,相关关系为M=e4.711m0.80.根据该方程的体质量指数(0.80),以实验鱼的平均体质量为标准体质量对各实验鱼的代谢率进行调整,得到雄鱼和Ⅱ,Ⅲ期雌鱼及Ⅳ期雌鱼的标准体质量代谢率的平均值分别为(174.5±9.9),(182.7±9.7),(191.4±9.6)mg/kg.h.性腺发育到Ⅳ期雌鱼的标准体质量代谢率高于发育到Ⅱ和Ⅲ期雌鱼的标准体质量代谢率,但统计检验表明二者间无显著差异(P＞0.05),雌雄鱼间静止代谢率差异也不显著(P＞0.05).还对影响大鳍鳠成鱼静止代谢率的主要因素进行了讨论.     

双头鱼的显微结构观察

在鲫鲤F2(红鲫(♀)×鲤鱼(♂))中,发现8尾双头畸形鱼.对这8尾双头鱼的胚胎发育、外形特征、存活时间及他们的显微结构进行了观察.结果表明:8尾双头鱼的共同特征是具有明显的两个头,两个心脏.其中7尾双头鱼为两个头部,一个身体;另1尾为两个头部,两个身体.组织学切片观察发现双头鱼头部发育正常,其中两对眼睛中可见正常发育的视杯、晶状体、角膜等结构;脑中可见两个明显分界的大脑;两个心脏具有正常的围心腔;腮裂、鳔和肠管等也发育良好.但所有双头鱼在出膜后10天左右开始相继死亡,死亡的原因与随着生长发育进程的进行,两个头部器官在内部生理和外部水环境中都存在相应的困难有关系.此外,鲫鲤F2中多尾双头鱼的形成与它们是属间的远缘杂交后代有关,亲缘关系较远的染色体之间的互作导致基因表达异常,导致出现较高比例的异常胚胎.