花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731(感病系)和C712(抗病系)作为材料,利用cDNA-AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况.获得了两个阳性克隆M2和M6.Nprthern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同.而M6是差异表达的cDNA片段.Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列.随后的序列分析发现M6 cDNA片段与拟南芥1号染色体的BAC F19P19中66 665～66 813 bp有84%同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列.推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91%同源性.用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现:M6 cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24 h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势.根据序列分析和初步的功能分析的结果推测:M6 cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段.是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段.     

簇毛麦(Haynaldia villosa)gibberellin 3β-hydroxylase基因的克隆和序列分析

以簇毛麦(Haynaldia villosa,2n=14,VV)为材料,提取总RNA,以大麦,小麦GA3ox序列设计同源引物,通过RT PCR方法,获得了簇毛麦GA3β-羟化酶(gibberellin 3β-hydroxylase,GA3ox)多基因家族中一个cDNA克隆,暂命名为HvGA3ox.该cDNA全长1206bp,含完整编码区1104 bp,推测该序列编码蛋白含368个氨基酸残基,分子量为40.063 KD,等电点为6.27.预测的氨基酸序列含有双加氧酶的活性结构,在酶活性中心2个Fe离子结合的氨基酸残基非常保守.该序列与小麦、大麦和水稻的GA3氧化酶基因一致性分别为98%、96%、86%.为以后进一步分析HvGA3ox的结构及其与功能关系,〖JP2〗还以簇毛麦总基因组为模板,扩增得到一个1582 bp的克隆,该序列与cDNA序列在外显子部分一致,在478~715 bp和879~1019 bp处分别含238 bp和140 bp的内含子.该基因的克隆为进一步研究该基因的功能和结构奠定了基础.     

葱蝇谷胱甘肽S - 转移酶基因的克隆与序列分析(动物科学)

谷胱苷肽S-转移酶(GST)是昆虫体内广泛存在的一类解毒酶,可以保护机体免受内源性或氧化物的损害。昆虫对一些杀虫剂的抗性与GST表达水平增高有关。GST的研究主要集中在杀虫剂抗性上,可将其作为昆虫的药物靶标,设计和开发新型的杀虫剂。采用RACE的方法,克隆了葱蝇(Delia antiqua)GST基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:JQ625502),获得的cDNA全长874bp,其中阅读框ORF 627bp,编码208个氨基酸,推测其相对分子质量为23.9kD,等电点为5.83。通过该基因推导的氨基酸序列与其它物种的GST蛋白进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与丝光绿蝇(Lucilia cuprina)的谷胱甘肽转移酶氨基酸序列同源性最高。该结果进一步丰富了GST基因的基础数据,有助于葱蝇的杀虫剂抗性机理和发育机理的相关研究。     

花椰菜（Brassica oleracea vat．botrytis）抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731（感病系）和C712（抗病系）作为材料,利用cDNA—AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况．获得了两个阳性克隆M2和M6．Northern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同．而M6是差异表达的cDNA片段．Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列．随后的序列分析发现M6cDNA片段与拟南芥1号染色体的BACF19P19中66665～66813bp有84％同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列．推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91％同源性．用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现：M6cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势．根据序列分析和初步的功能分析的结果推测：M6cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段．是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段．     

诸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列分析

烯醇式丙酮基莽草酸 3 磷酸合成酶(5 enolpyruvylshikimate 3 phosphatesynthase,EP SPS)是植物和微生物莽草酸途径中的一个必需合成酶,植物中该基因的超量表达或该基因中某些氨基酸突变可以产生对除草剂草甘膦(glyphosate)的耐性.采用5′ RACE技术从诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)叶中克隆出一条长743bp的cDNA片段.序列分析结果表明:该cDNA与其它植物的EPSPS基因具有相当高的核苷酸序列同源性.其所编码的氨基酸序列与欧洲油菜(Brassicanapus)同源性最高为90%,与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、西红柿(Lycopersiconesculentum)、烟草(Nicotianatabacum)和水稻(Oryzasativa)的同源性分别为88%,81%,64%,62%和71%.     

簇毛麦3V和4V染色体特异分子标记的建立

选用100条ISSR引物对多年生簇毛麦(Dasypyrum breviaristatum)、不同居群的二倍体簇毛麦(D.villosum)、小麦多年生簇毛麦部分双二倍体(TDH-2)、二粒小麦多年生簇毛麦双二倍体(TDB-3)、硬粒小麦二倍体簇毛麦双二倍体(ABV)和6份小麦进行PCR分析.结果发现引物ISSR808和ISSR811均可以在含簇毛麦染色质材料中扩增出1条约900 bp的特异DNA带,而对照组小麦则没有相应带纹.对这两个特异片段进行克隆测序,发现其长度分别为860 bp和898 bp, 分别被命名为ISSR808860和ISSR811898.序列比对结果显示(1)ISSR808860与一粒小麦(Triticum monococcum)和大麦(Hordeum vulgare)基因组LTR反转录转座子部分序列同源性分别达到83%和81%(2)ISSR811898与普通小麦(riticum aestivum)Wknox1d基因的部分内含子序列具有88%的同源性.利用中国春簇毛麦附加系(CSDA1V-CADA7V)分别将ISSR808860定位在3V和4V染色体上, 将ISSR811898 定位4V染色体上.用ISSR808和ISSR811对多年生簇毛麦的大量衍生后代进行PCR分析,结果表明ISSR808860和ISSR811898可以作为检测簇毛麦3V和4V染色体的分子标记应用到辅助小麦育种工作中.     

赤点石斑鱼ICLP基因的克隆和序列分析

MHC class II invariant chain-like proteins(ICLP)因子与免疫反应密切相关,其参与对抗原的处理,保证多肽不被进一步降解为氨基酸.通过RACE反应获得赤点石斑鱼ICLP2cDNA全序列,全长1 837 bp,包括44 bp的5′UTR区,861 bp的开放阅读框以及932 bp的3′UTR区.编码286个氨基酸,推测的蛋白质分子量为31 878 u.对赤点石斑鱼10个组织的ICLP2基因进行PCR扩增和测序,结果表明赤点石斑鱼ICLP2基因的表达不存在组织特异性.此外,氨基酸序列同源比对的结果表明,赤点石斑鱼与其它16种脊椎动物ICLP2的相似度在25%～78%之间,与狼鲈和鳜鱼ICLP2因子的同源程度最高,分别为78%和74%.根据ICLP的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树,表明了该分子的氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好指标.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

龙胆FtsZ基因的克隆及其在花瓣发育过程中的表达

以用RT-PCR从龙胆中克隆的FtsZ基因的cDNA片段(约800bp)作为探针,从cDNA文库中筛选到全长cDNA.递推氨基酸序列分析表明,该cDNA编码的多肽具有FtsZ蛋白的典型保守序列,N端氨基酸序列具有质体导肽特征,推测在叶绿体内起作用.随着龙胆花瓣发育进程,与质体分裂相关的FtsZ基因表达逐渐减弱,类胡萝卜素生物合成代谢途径中的Zds基因表达逐渐增强;叶绿素含量降低而类胡萝卜素含量增高,叶绿体逐渐转变成花色体,花色由绿转黄.     

褐飞虱细胞色素P450基因cDNA片段的克隆、测序及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱细胞色素P450基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为237bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自烟草天蛾、棉铃虫、埃及伊蚊、家蝇、黑腹果蝇和线虫的CYP6家族的P450的氨基酸序列存在同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,P450基因的表达水平明显升高.以上结果表明,P450基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在褐飞虱对抗性水稻的耐受性和解毒方面可能起着重要作用.