水稻OsDTH13基因编辑突变体的创制与分析

为了揭示水稻的PEBP基因家族成员OsDTH13的功能,以粳稻品种中花11为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术创建了该家族成员OsDTH13的基因编辑突变体,对获得的编辑突变体进行测序分析确定其编辑类型.选择目的基因编码区的2个靶点,将其构建到基因编辑表达盒中获得了重组载体,并将重组载体导入农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化法获得13株T_0代转基因阳性植株.经过测序鉴定,发现5株在靶点位置发生了编辑,其中2株为单碱基插入,3株为小片段的缺失.通过自交获得了T_1代纯合突变体植株.对获得的纯合突变体进行验证,发现其可以稳定遗传到下一代,这表明CRISPR/Cas9重组载体成功地对OsDTH13进行了编辑.     

RNA靶向基因组编辑技术CRISPR/Cas9在昆虫中的研究进展

介绍CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制、脱靶效应以及在昆虫基因编辑和基因功能研究中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行展望,为进一步将该技术应用于非模式昆虫的基因编辑和基因功能研究提供参考.     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行Western Blot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究.     

基因编辑技术原理及其在动植物研究中的应用

自人类基因组计划开展以来,越来越多生物的基因组序列得到了测定,基因的功能逐步得到鉴定.人们期望通过对基因表达的改变,来治疗人类疾病或提高生物的产量和品质.早期突变技术对基因的改变是不定向的,近年来,锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9等技术可对某个已知基因进行编辑.特别是CRISPR/Cas9技术,由于具有操作方便、效率高等优点,因此成为对基因进行定向操作的强有力工具.本文对几种基因编辑技术的原理和应用进行简要介绍和展望.     

水稻中5个FT-Like家族成员的基因编辑突变体的创建与分析

为了揭示水稻中FT-like亚家族成员的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术对其中的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11进行基因编辑.在5个基因的编码区各选择1个靶点构建1个融合的sgRNA表达框,将表达框装载到CRISPR/Cas9表达载体中,通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻...     

CRISPR/Cas9技术联合AAV对Rosa-mTmG小鼠的MEF细胞进行编辑

目前,基因编辑技术已被广泛用于生物医学研究,本研究利用AAV(Adeno-Associated Virus)递送CRISPR/Cas9系统,实现高效率的基因编辑,并对特定组织细胞中的基因编辑进行了初步探索.我们首先采用Rosa-mTmG转基因小鼠来研究CRISPR/Cas9在小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)中的编辑效率;接着,我们构建了能够被AAV包装的SaCas9系统,并通过瞬转以及AAV介导递送的方式检测其基因编辑效率;最后,我们还构建了含有心肌特异启动子的cTNT-PX601-sgRNA以备后续研究.结果发现,与瞬转相比,AAV介导CMV-PX601-sgRNA在体外能够极大地提高细胞的基因编辑效率.另外,cTNT-PX601-sgRNA能够在心肌细胞中特异表达.我们的结果表明,利用AAV介导的CRISPR/Cas9系统在体外可以实现高效地基因编辑,为靶向修复基因缺陷疾病,特别是特定组织器官中的基因缺陷,提供了研究工具和实验依据.     

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD 载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测，本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统，根据PPARD基因结构和序列特点，设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列，将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞，提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后，通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白，利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现，PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比，PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体，并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑，将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率，推进对PPARD基因的功能研究。     

新型基因编辑技术CRISPR/Cas9系统研究现状

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌防御外来噬菌体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统.依据Cas蛋白种类和同源性,CRISPR/Cas系统被分为3类,其中,Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白参与,而Ⅱ类系统,即CRISPR/Cas9组成简单,仅需Cas9蛋白参与即可.经过遗传工程改造后的CRISPR/Cas9已经作为一种新型的基因编辑工具被用于多种生物的基因组编辑.本文就CRISPR/Cas9系统的发现、结构组成、作用机制、研究现状、面临的困境及应用前景等几方面进行了总结.     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

gRNA二级结构对拟南芥HD2基因CRISPR/Cas9编辑率的影响

近年来,利用基因编辑工具编辑特定基因逐渐成为一种获得突变体的主要方法。CRISPR/Cas9编辑技术是目前最新和最高效的基因编辑技术。然而,这一技术在植物中的编辑率受到很多因素的影响,例如如何设计gRNA以及如何避免脱靶效应等。为了探究gRNA的二级结构对拟南芥基因编辑的影响,我们选择了拟南芥基因组中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族中一个植物特有的亚家族(HD2)为靶基因,通过设计这一亚家族中3个HD2基因不同的CRISPR/Cas9靶点,观察不同gRNA接头二级结构对CIRSPR/Cas9编辑率的影响。结果显示：不同gRNA接头二级结构对基因的编辑率会有一定的影响,当二级结构由一段单链RNA、5个茎环、2个突环和3个发夹环组成的时候,编辑率最高。该研究可为后续人们使用以tRNA为策略设计gRNA的CRISPR/Cas9工具时选择合适的靶点,为提高基因编辑率提供基础。     

基因组编辑植物的监管与检测技术

 基因组编辑技术是利用人工核酸酶对生物体目标基因序列进行修饰的技术。近年来,以CRISPR/Cas系统为代表的基因组编辑技术由于高效、简单的操作发展迅速,为研究动植物基因功能、疾病治疗、植物分子育种等方面提供重要的方法。同时,由于基因编辑产品的不断出现,为政府监管提出了更高的要求。通过介绍植物基因组编辑技术及其产品的种类,重点说明了主要国家、经济体在植物基因组编辑产品的安全监管的异同,概述了科学界对基因编辑作物的基本原则,并介绍了几种植物基因组编辑产品的检测方法。     

基因编辑技术在花卉育种中应用的研究进展

相较传统育种,基因编辑育种能够更精准、高效地改变植物的性状,获得优良的品种.目前应用基因编辑技术于花卉育种研究的报道相对较少.该文综述了基因编辑技术,特别是规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR-关联核酸内切酶9(CRISPR/Cas 9)在花卉中的研究进展及其局限性,同时还就花卉基因编辑育种的发展方向进行了讨论,希望为将基因编辑更好地应用于花卉育种提供参考.     

单基因遗传疾病的基因疗法

 基因疗法是全球突破性技术之一，在单基因遗传疾病治疗中已取得突破性进展。阐述了不同的基因疗法策略、载体和基因编辑技术的特点，综述了脊髓性肌萎缩症、Leber先天性黑蒙2型、血友病、β-地中海贫血的发病机理、临床表现、基因疗法的开发进程以及临床试验情况。目前，上述4种单基因疾病的9种基因疗法已分别取得美国食品药品监督管理局突破性疗法资格、欧洲药品管理局的优先药物资格或者已经批准上市。基因疗法的研究还面临着许多挑战，但随着科学研究的深入和科学技术的不断发展，将有更多的患者获得治疗。     

Cationic polymeric nanoformulation: Recent advances in material design for CRISPR/Cas9 gene therapy

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/clustered regularly interspaced short palindromic repeat associated proteins 9) gene editing platform is a promising therapeutic tool for genetic disorders, due to its ability to manipulate the pathogenic gene in genomic level and to easily target specific gene by manipulating single-guide RNA. However, its successful delivery remains a challenge. Up to now, great efforts have been made to explore an effective strategy for CRISPR/Cas9 delivery. But among those delivery methods, physical methods are mainly operated on cultured cells thus limited to laboratorial use; viral vectors are hindered by fetal immunogenic and carcinogenic effects thus dubious in clinical application. Therefore, cationic polymeric vectors, with the ability to interact with CRISPR/Cas9 system to form a nanoformulation as a non-viral approach, are attracting increasing attentions, due to advantages such as well protection of cargos, less limitation in payload size, low immunogenicity or carcinogenicity, potential modifications for further functions, and ease in mass production. In this review, the recent discoveries on polymeric vectors utilized in delivery of CRISPR/Cas9 system will be summarized. With emphasis on advanced features of those polymeric vectors or their nanoformulations to meet the demands of different CRISPR/Cas9 delivery forms (plasmid, mRNA or protein), the detailed illustrations on their disease treatment applications, such as cancer, diabetes or antibiotic-resistant infections, will also be reviewed.     

CRISPR/Cas技术在木本植物改良中的应用

木本植物育种周期长、种质资源匮乏,已成为限制木本植物种质创新的主要因素。CRISPR/Cas系统是近年来发展起来的能够实现对基因组进行精准定点编辑的技术,具有操作简单、周期短、效率高等优点,可实现基因的敲除、插入、替换等目的,从而精确地引入目标性状。目前,该技术已在多种家畜、昆虫、作物中得到了成功应用,对大量性状进行了改良,实现了种质资源的原始创新,大大缩短了育种年限。CRISPR/Cas技术的产生为木本植物的遗传改良提供了契机。笔者对CRISPR/Cas技术在杨树(Populus spp.)、苹果(Malus spp.)、柑橘(Citrus spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、木薯(Cassava spp.)等木本植物育种中的应用进行了总结,该技术实现了T0代木本植物优良基因型的固定,在生长、材性、抗病性、抗旱性等性状上得到了明显改善,加快了木本植物育种进程,提高了育种效率。但该技术在木本植物中的应用尚处于起步阶段,还存在脱靶率高、编辑效率低、纯合突变少等问题。基于此,对CRISPR/Cas技术在木本植物中的应用前景进行了展望,以期为木本植物基因功能研究及品种改良提供有益参考。     

诱导多能干细胞与心脏再生

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)研究的快速发展为心血管转化医学研究领域提供了新的策略. 诱导多能干细胞不仅具有与胚胎干细胞类似的多能性, 且巧妙地回避了胚胎干细胞面临的伦理学问题和免疫排斥反应. 心肌细胞等成体心血管细胞在发生心血管疾病后增殖能力有限, 而iPSCs 来源的心血管细胞在心脏再生治疗中颇具应用前景,是理想的细胞来源, 因此在基础医学和转化医学研究领域受到广泛关注. 就iPSCs 的发展过程及其在心脏再生中的应用作一综述, 并探讨目前iPSCs 在心脏再生临床转化中亟待解决的问题.     

非编码RNA调控心脏重构与再生

近年来, 越来越多的证据表明, 大量的非编码RNA(non-coding RNAs, ncRNAs)在基因的表达调控、细胞和机体的生理功能维持与病理环境调节方面都有重要作用, 其中主要包括微小RNA(microRNAs, miRNAs) 和长链非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs).心脏重构与再生是心血管疾病领域的关键问题, 其调控过程非常复杂, 包括表观遗传、转录、转录后及翻译水平的调控. 大量研究发现在转录后水平, miRNAs 通过负性调节靶标的表达调控心脏发育、疾病及再生进程. 近期研究揭示, lncRNAs 在心脏发育和疾病中具有潜在的作用, 可通过表观遗传、转录及转录后水平发挥作用. lncRNAs 已成为继miRNAs 之后的又一重要的调节性非编码RNA. 就非编码RNA 在心脏重构及再生进程中的调控作用进行综述.     

农作物病毒病害绿色防控技术创新

作物病毒病害是限制我国农作物优质稳产的主要因素之一,其主要由媒介生物传播,作物普遍缺乏抗病毒病的种质资源,病毒病害防治难度大,主要依赖化学农药通过防控媒介昆虫进行控制。近年来,随着纳米生物学、分子生物学和组学研究的飞速发展,以及微观生物学技术和理念对宏观生物学的快速渗透与交叉,基因组编辑技术的快速发展,病毒—昆虫—植物三者互作机制等各方面研究取得了诸多重要进展,在寻找病毒病害流行爆发的宏观生态学现象背后的分子生物学与生物化学机制上取得了长足进步,从而促进新型病毒病害的持久防控技术的发展,提供了科学依据和潜在新方案。文章简要回顾了近年来这些新技术的主要机理,并抛砖引玉提出了对未来发展的建议和思考。建议国家和社会组织研究力量,大力加强1)探索利用微纳米递送化学药物或者核酸干扰等防治病毒病害的新方法研究;2)病害发生的多元生物体系互作机制及科学防控科技支撑能力建设;3)基因组编辑创建病毒病害绿色防控的技术等方向的探索与突破,力求在病毒病害绿色生态防控方面为农业提供强有力的科技创新和支撑能力。     

中药提取物声敏剂在声动力治疗动脉粥样硬化中的应用

目前, 动脉粥样硬化引起的心血管疾病发生率越来越高, 除昂贵的介入和搭桥治疗术外, 寻求一种简单、有效且经济的治疗方法至关重要. 声动力治疗是一种无创、安全的治疗方式, 其在动脉粥样硬化治疗中的应用很有前景. 声动力治疗中使用的药物为声敏剂, 是影响其疗效的主要因素之一. 研究人员一直致力于探讨不同种类声敏剂所带来的声动力效果在动脉粥样硬化治疗中起到的不同作用. 近年来, 在声敏剂的筛选研究中发现, 中药提取物有很大的潜在声敏剂价值. 简要总结了目前对声动力治疗机制及大黄素、姜黄素及其衍生物和金丝桃素作为声敏剂在声动力治疗动脉粥样硬化中的相关进展.     

基因修饰猪作为人类疾病模型的研究进展

 对近来有关基因修饰猪作为人类疾病模型的研究进行综述。建立疾病动物模型有利于探索疾病的致病机制,开发治疗药物和诊治途径,是人类疾病临床前研究的重要环节,对实验到临床(B2B)的转化医学研究至关重要。通过基因修饰手段获得的带有人类疾病的模型动物具有遗传稳定性和来源的可重复性,对相应人类疾病的研究更具有举足轻重的作用。由于与人类生理特征具有诸多相似性,猪可以作为良好的人类疾病动物模型,并且比传统的啮齿类疾病动物模型更具有优势。随着大动物胚胎操作技术和基因操作技术的日渐成熟,近年来对通过基因修饰猪建立的人类疾病模型的研究进展也逐步加快。