HBD的N端融合蛋白的跨膜转导作用

研究人源性穿膜肽HBD的N端融合蛋白的跨膜转导作用。通过DNA重组技术将HBD融合在EGFP蛋白的氨基端(N端),构建重组质粒pET28b-HBD-EGFP-Histag,经IPTG诱导表达和Ni 2+-NTA纯化,获得重组蛋白HBD-EGFP。通过激光共聚焦显微镜定性观察及流式细胞仪定量检测发现,融合在EGFP氨基端的HBD跨膜转导效率比融合在EGFP羧基端(C端)的HBD转导效率提高了约10倍。实验结果表明,N端融合的HBD-EGFP对于外源蛋白具有跨膜运输效果,且比C端融合的HBD具有更高的跨膜转导效率。该结果可为HBD在抗癌药物递送方面的有效应用提供理论依据。     

影响HIV-GP41N端1/2在E.coli中表达的两段氨基酸序列界定

GP41蛋白二级结构预测显示 ,前 1 /2片段的 N端 ( 4～ 2 6位氨基酸 )和 C端 ( 1 67～ 1 89位氨基酸 )各有一个富含疏水氨基酸的穿膜螺旋 (可能性 >0 .9) ,分别从 N1 (前 1 /2片段无 C端穿膜螺旋 )的 N端和 N6(前1 /2片段无 N端穿膜螺旋 )的 C端进行缺失构建一系列缺失突变体 ,只有 p ET-N2 ,p ET-N3 ,p ET-N4,p ET-N5在大肠杆菌中获得高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 % ,Western blot显示表达蛋白与 HIV阳性血清有良好的反应性 .而 p ET-N1 ,p ET-N6在大肠杆菌中表达量很低或不表达 .从而证明 1～ 6位 ,1 84～ 2 0 1位氨基酸是影响 gp41基因 N端 1 /2片段表达的主要因素     

棉纤维细胞色素单加氧酶基因GhCYP714A1促进活性氧的累积

本研究利用RT-PCR技术从陆地棉纤维组织中克隆得到了1个棉花细胞色素P450基因(Cytochrome P450714A1)的全长c DNA序列,将该基因命名为GhCYP714A1。序列分析发现,该cDNA包含1563 bp的完整开放读码框,编码521个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为57.31 kDa;氨基酸序列生物信息学分析显示,Gh CYP714A1蛋白具有跨膜结构域和多个蛋白结合位点;进化树分析结果表明,棉花Gh CYP714A1与禾草SiCYP714B1在进化上亲缘关系上较近;半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhCYP714A1基因与纤维突起形成发育有关。本研究构建了pET28a-GhCYP714A1原核表达载体并进行体外诱导表达,获得分子质量约为57.31 kDa的重组蛋白。将GhCYP714A1基因转化烟草验证其参与活性氧产生的功能,与非转基因的野生型烟草相比,转基因烟草叶片中具有较高的H_2O_2累积。本实验结果为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。     

室温下的小蛋白折叠研究

目前,无论在实验还是理论研究方面,研究蛋白质的从头折叠即使是小蛋白的折叠也非常困难.在室温下研究蛋白质的折叠过程可以有效的阐述蛋白质折叠机制.笔者从2I9M的线性结构出发,在室温下运行了15 ns的分子动力学模拟,发现它在6.4 ns时成功折叠到了天然态结构,此时的结构与天然态结构的均方根偏差为1.17(A),模拟结构与天然态结构符合的非常好.折叠过程是首先在C端出现了螺旋,随后N端又出现了螺旋,然后螺旋从N端鱼贯式生成,最终形成天然态结构.     

质膜微囊蛋白3的功能与相关疾病研究进展

质膜微囊蛋白3(CAV3)主要存在于各类肌肉组织(骨骼肌、心肌、平滑肌和膈肌)的质膜微囊内,促使肌细胞质膜微囊的形成.就CAV3的结构、主要功能、表达特性、相关肌肉疾病和发病机制进行综述.CAV3蛋白由151个氨基酸组成,被分为4个区域:N端区、脚手架区、跨膜区和C端区;CAV3在肌肉质膜微囊上参与行使各项生物功能,包括细胞信号传导、离子通道运输和能量代谢;CAV3可调控成肌细胞的生存力和分化,其正常生理水平的表达是肌肉发育和生理功能正常行使的关键因素;发生在CAV3上的突变可导致神经肌肉疾病和心肌疾病,主要包括LGMD、RMD、DM、H-CK和GHC,其发病机理涉及多方面遗传和环境因素.     

利用分离型内含肽DnaE表达抗菌肽

拟验证天然断裂内含肽Npu Dna E、Ssp Dna E的反式剪接反应对嵌合蛋白形成的影响,探讨依据此方法表达抗菌肽的可行性,规避抗菌生物表达中对宿主的毒害作用.将花蝉属抗菌肽ADP-1(Amblyomma defensin peptide 1)拆分为N端和C端两部分,其N端与断裂型内含肽Npu Dna E的N端融合,C端与Ssp Dna E的C端融合,并分别构建到原核表达载体p ET-23a(Amp+)和p ET-30a(Kan+)上,获得重组表达质粒p ET-23a-ADP-1-N-Npu和p ET-30a-Ssp-ADP-1-C,然后单独或共转化大肠杆菌感受态细胞BL21.实验结果表明,两个重组质粒分别单独或组合转化至Bl21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测转化的菌株中都表达了目的蛋白,共转化的菌株诱导表达破菌后其上清液有抑菌活性.该实验验证以两种天然断裂型内含肽Ssp Dna E和Npu Dna E及搭载的ADP-1 N端和C端可在大肠杆菌中获得表达,且共转化的两段内含肽可在离体上清中发生反式剪接,促进融合在内含肽上的ADP-1两部分形成完整具有抑菌活性产物.     

CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

为设计筛选针对人CD226分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对Jurkat/E6细胞膜表面天然CD226分子表达水平的影响,首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与CD226分子真核表达载体共同转染293T细胞,挑选出最有效抑制CD226表达的序列。应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因CD226的siRNA慢病毒载体。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清,感染Jurkat/E6细胞系,对病毒感染效果进行检测。结果在4条针对CD226分子设计的siRNA序列中,siRNA—513最为有效的抑制了外源性CD226分子的表达,带有该序列的慢病毒载体pLKO—CD226可以完全抑制Jurkat/E6细胞上天然分子的表达。说明应用基因工程技术成功构建了针对CD226分子的RNA干扰慢病毒载体,为深入研究人类黏附分子CD226在机体免疫功能方面提供了技术支持。     

甘草四种活性成分药酶诱导作用研究

为研究甘草内4种潜在活性成分甘草酚、甘草查尔酮A、甘草异黄酮A、异甘草黄酮醇对体外I相与II相药物代谢酶的激动活性,探讨甘草解毒的分子机制。通过系统药理学方法筛选甘草内口服生物利用度(OB)较高的化合物,体外建立Hep G2与A549的药酶诱导体系,MTT法正反向验证I相与II相药物代谢酶的激动显著减轻顺铂对细胞的毒性,RT-PCR法检测A549细胞中核转录因子Nrf-2和Hep G2细胞内肝微粒细胞色素P4503A4(CYP3A4)基因的表达,Western blotting法检测Hep G2细胞内CYP3A4蛋白的表达。高OB的4种潜在活性成分均能诱导I相与II相药物代谢酶。由此可知,甘草酚、甘草查尔酮A、甘草异黄酮A、异甘草黄酮醇可以激活A549细胞内Nrf-2及Hep G2细胞内CYP3A4的表达,结合上述化合物潜在的高生物利用度,认为其在甘草解毒机制中发挥重要的作用。     

拟南芥MtN3/saliva基因家族分析

MtN3/saliva基因家族是含有2个MtN3/saliva跨膜结构域的膜整合蛋白,其成员广泛存在于真核生物中.目前对该家族功能研究较少,对其跨膜结构域的分子功能还不清楚.在拟南芥中该家族有18个成员,除了最近克隆的RPGl以外其他MtN3/saliva基因的功能均不清楚.对拟南芥MtN3/saliva基因家族进行了较为全面的分析,包括基因结构、染色体分布、蛋白结构域、系统进化关系、基因表达谱等.对其中预测在花药中高表达的4个基因进行了实时定量PCR分析,证实有3个基因在花中高效表达.这些结果促进了对MtN3/saliva基因家族的深入了解.     

Tat-p21融合蛋白的表达及其在A549细胞中的活性研究

在本研究中,通过分子克隆的手段,将编码Tat跨膜转运结构域的CDS与人野生型p21蛋白的CDS相连接,并通过原核表达系统表达纯化相应蛋白;然后用该蛋白按浓度梯度:100,200,400,800,1000nmol/L与A549细胞共同孵育,各浓度在10,60,120,240min终止反应,通过Western Blotting检测进入细胞的p21蛋白量,以此确定最佳的转导条件;接着检测了转导进入A549细胞的Tat-p21融合蛋白在细胞中稳定存在的时间.然后通过绘制细胞生长曲线的方法比较了转导Tat-p21的细胞与负对照实验组生长速度的区别.结果发现,融合Tat跨膜结构域的p21蛋白能够高效进入A549细胞,并在细胞内发挥相应生物学功能,使细胞的生长受到抑制,增殖减慢;而作为负对照的p21蛋白则无相应功能.