cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草. Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm)基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高. 以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

病毒诱导的烟草DHS基因的沉默

将本生烟草(Nicotiana benthamiana) DHS (deoxyhypusine synthase, 脱氧羟腐胺赖氨酸合酶)基因的cDNA片段插入到马铃薯X组病毒(PVX)载体中, 构建重组病毒载体PVX-NbDHS. 通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统, 抑制本生烟草DHS基因表达. 感染植株表现为生长增强、叶片叶绿素含量下降、叶片衰老延缓和开花推迟. 半定量RT-PCR和Northern blot结果表明, PVX-NbDHS-VIGS植株中DHS mRNA丰度显著下降. Western blot检测表明, DHS靶蛋白eIF-5A的表达量与DHS呈平行下调变化. 综合分析植物表型和相应基因表达水平, 可以推断DHS在植物生长与发育中起重要作用.     

两种植物病毒编码蛋白的基因沉默抑制子功能鉴定

采用农杆菌浸润方法以及重组的马铃薯X病毒(PVX)表达载体, 研究了甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)编码的P14蛋白和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)编码的S6蛋白对植物基因沉默的抑制作用. 绿色荧光蛋白(GFP)表型观察及核酸杂交结果表明, 这2种病毒基因均能够强烈抑制转基因本生烟(16C)中由同源序列引起的gfp基因沉默, gfp基因mRNA的含量明显高于未发生沉默抑制的对照植株, 并导致PVX感染后的寄主症状加重, 说明它们可能是由病毒编码的RNA沉默抑制因子. 其中, RBSDV S6基因对植株体内基因组DNA甲基化过程的抑制作用更为强烈.     

用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子. 首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上, 构建成诱饵质粒pGBD-nifA, 接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1, pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上, 形成3个质粒文库YSPC1, YSPC2和YSPC3. 然后以pGBD-nifA为诱饵, 对YSPC1, YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选, 得到11个阳性克隆. DNA序列分析表明, 这11个阳性克隆分为4类, 包含4个1~1.3 kb不同的基因片段. 对这4个基因片段进行同源性比较发现, 其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域, 另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因, 另一个是未知蛋白. 将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体, 即互换换载体后, 它们仍然与NifA有相互作用; 对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用, 说明了它们与NifA相互作用的特异性.     

大豆疫霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因在病原物植物互作中诱导表达及其抗氧化作用在酵母遗传互补系统中的功能验证

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是真核生物细胞中一类功能丰富的蛋白质. 采用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)的方法, 筛选到一个在大豆疫霉侵染早期上调表达的、编码GAPDH的cDNA片段; 克隆了该基因的全长序列, 命名为PsGapdh. Southern杂交结果显示, PsGapdh在大豆疫霉基因组中含有3个拷贝. 该基因编码的氨基酸序列具有GAPDH的保守结构域. 在系统发育树中, PsGAPDH与两性绵霉(Achlya bisexualis)的GapC1同源性最高、与中华盒形藻(Odontella sinensis)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的GapC2同源性较高, 三者聚类分布于GapC亚族的C-Ⅱ分支. RT-PCR分析表明, 该基因在大豆疫霉侵染早期转录水平提高. 该基因可以恢复酵母突变体Δtdh1对H₂O₂的耐受性. 上述结果提示, 大豆疫霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有与酵母tdh1相似的抗氧化作用, 且参与了大豆疫霉对寄主植物的侵染过程.     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

表达Cryptogein基因的烟草抗病性和耐盐性增强

隐地蛋白(cryptogein, Crypt)是由隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)分泌的一种分子量约为10 kD的蛋白类激发子. 用农杆菌介导的叶盘转化法获转Crypt (PAL::Crypt)和CryK13V (CaMV35S::CryK13V)基因的烟草植株. 接种试验结果表明, T₂代转基因烟草株系对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var nicotiana, Ppn)、赤星病菌(Alternaria alternata)和野火病菌(Pseudomonas syringae pv tabaci)的抗性显著增强. Northern杂交和RT-PCR分析结果表明, 低水平的表达转化基因Crypt和CryK13V就足以激活PR-1a和PR-5等防卫反应相关基因的表达; 在PAL::Crypt转化系统中, 病原菌Ppn能快速和高水平诱导PR-1a等病程相关基因的表达, 表明诱导型PAL启动子对入侵病原菌能及时识别并快速、有效地激活防卫反应, 从而赋予转基因植株抵抗病原菌侵染的能力. 研究还发现, 表达Crypt和CryK13V基因的烟草植株耐盐性比对照明显提高, 转化株系中高水平组成型表达PR基因和转录因子可能与耐盐性增强有一定正相关性. 上述结果表明, 植物对生物和非生物逆境的抗性途径和机制存在着交叉.     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

疫霉菌激发子PB90诱导烟草悬浮细胞的凋亡

激发子PB90是疫霉菌(Phytophthora boehmeriae)分泌的一种分子量为90 kD的胞外蛋白激发子, 该激发子可以诱导非寄主植物烟草的过敏反应和系统获得抗性. BY-2烟草悬浮细胞经该激发子PB90处理后, Trypan blue染色观察到细胞死亡, 这种死亡可被蛋白质合成抑制剂Cycloheximide抑制, 表明这种细胞死亡是主动死亡过程. 提取PB90处理的悬浮细胞的DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察到DNA Ladder现象, 表明核小体间的DNA发生了断裂; 对经PB90分别处理4和12 h的烟草悬浮细胞进行TUNEL染色, 观察到较强的阳性信号, 进一步表明其细胞核内发生了DNA末端断裂; 同时结合DAPI染色观察到经PB90处理后的细胞染色质凝集、细胞核解体形成凋亡小体等细胞凋亡的形态学特征. 上述结果表明激发子PB90可以诱导BY-2烟草悬浮细胞发生细胞凋亡, 提示该激发子诱导的过敏反应是一个细胞凋亡过程.     

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因的cDNA克隆及其表达

用cDNA差示分析法从G2豌豆总RNA中筛选到一个GA3特异诱导表达的基因片段，用该片段作探针进一步筛选G2豌豆cDNA文库，得到一个全长2036bp的cDNA序列。经分析，该cDNA含有一个1746bp的可读框，编码的蛋白质含有581个氨基酸，理论分子量为64ku,cDNA及推导的氨基酸序列分别与不同来源的乙酰羟酸还原异构酶相应序列有较高的同源性。将该基因转入表达载体中并在大肠杆菌中表达，获得了具有显著酶活性的外源蛋白。     

13个水稻WRKY基因的克隆及其表达谱分析

转录调控因子WRKY蛋白拥有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和Cys₂His₂或Cys₂HisCys锌指型结构. 利用WRKY蛋白质的保守结构域, 搜索了整个水稻基因组编码WRKY蛋白质的基因, 鉴定了97个WRKY基因, 并从4℃胁迫的水稻植株cDNA文库中获得13个WRKY基因全长cDNA克隆. Northern blotting分析结果显示, 其中10个WRKY基因的表达受到NaCl, PEG, 低温(4℃)和高温(42℃)等4种非生物逆境因子胁迫的影响, 但其诱导表达模式不论在逆境因子种类还是在诱导时间上均存在着很大的差异, 这种基因诱导表达模式的差异可能体现于它们之间的生物学功能的差异.     

通过叶绿体基因工程在烟草中合成中长链羟基脂肪酸聚酯

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs)属于微生物聚酯. PHA合酶(PHA synthase, 由phaC基因编码)和3-羟酰基-酰基转移蛋白-辅酶A转移酶(3-hydroxyacyl-acyl carrier protein-coenzyme A transferase, 由phaG基因编码)是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶. 以aadA(氨基糖苷-3′-磷酸转移酶)基因做筛选标记, 分别构建了含phaC2基因的单价叶绿体转化表达载体pTC2以及同时嵌合phaC和phaG基因的双价叶绿体转化表达载体pTGC. 通过PDS1000/He基因枪转化法转化烟草, 获得具有壮观霉素抗性的叶绿体型转基因烟草植株, PCR和Southern Blot结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中且基本达到同质化. 气相色谱法检测转基因株系中的mcl-PHAs含量最高达4.8 mg/g干重, 合成的PHAs单体主要成分为3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoate, 3-HO)和3-羟基癸酸(3-dydroxydecanoate, 3-HD). 透射电子显微镜观察到转基因烟草叶片叶绿体中确有PHAs颗粒累积.     

棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆和表达特性分析

根据不同植物编码半胱氨酸蛋白酶基因的保守序列, 设计兼并引物, 通过PCR 和RACE技术, 从辽棉9号衰老叶片中克隆了编码半胱氨酸蛋白酶的cDNA, 其相应的基因命名为Ghcysp, 该基因序列的长度为1368 bp, 包含一个1034 bp的可读框, 编码344个氨基酸, 分子量为37.88 kD, 等电点为4.80. 数据分析结果显示, 该蛋白质由1个19个氨基酸残基组成的信号肽和3个酶活性催化反应中心组成, 是一个跨膜蛋白质, 位于液胞膜上. Ghcysp蛋白质与其他植物半胱氨酸蛋白酶的氨基酸同源性为67%~82%. Northern杂交结果表明, 在棉花衰老的根、脱落的花、下胚轴、胚珠和幼叶中, Ghcysp基因不表达, 在棉花的衰老叶片中Ghcysp基因表达量高.     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶AtPLC6基因的克隆与表达

利用文库筛选和RT-PCR方法, 从拟南芥中克隆到长度为1954 bp, 包括全长1734 bp编码区的AtPLC6 cDNA, 推测其编码一含有578个氨基酸的多肽, 其等电点为7.24, 分子量为66251.84 Da. 在GenBank中进行序列比对发现, AtPLC6为一新发现的拟南芥PI-PLC基因. 对推测的氨基酸序列结构的分析表明, AtPLC6具有EF手性结构、X结构域、Y结构域和C2结构域, 与植物中已知的其他磷酸肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)在结构上相似, 类似于动物中典型的δ-型磷酸肌醇特异性磷脂酶. 将AtPLC6的编码区序列插入原核表达载体后进行了原核表达, 纯化的AtPLC6重组蛋白可水解PIP2产生IP3和DAG, 且水解活性呈明显的钙依赖特性, 反应的最适Ca²⁺浓度为10 μmol/L. Northern分析结果表明, 在检测的根、茎、叶、花、果和幼苗中均有AtPLC6 mRNA的转录, 但转录水平较低. 用ABA, NaCl, 冷和热等胁迫处理的实验表明, AtPLC6 mRNA的转录受到冷胁迫的诱导, 而受ABA, NaCl和热等胁迫影响较小, 推测AtPLC6可能参与了植株对冷胁迫的响应.     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因. 利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合, 构建了含4892个单株的F₂定位群体. 同时, 利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库, 构建了一个覆盖目标基因位点的长约213 kb的跨叠克隆群. 根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列, 以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序, 设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位. xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离, 标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM, 物理距离约为24 kb. 对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测, 揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因. 对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

大豆GmNHX1在百脉根中的过表达研究: 体内Na+含量的降低是耐盐性提高的基础

从大豆中克隆到了液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白编码基因(GmNHX1)的全长cDNA, 包括5′端非翻译区464 bp, 编码区1641 bp, 3′端非翻译区486 bp, 共2591 bp. 该cDNA编码的GmNHX1蛋白共546个氨基酸, 具有典型的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白特征, 与已知功能的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白AtNHX1, OsNHX1及AgNHX1具有较高的同源性. GmNHX1在大豆基因组中为单拷贝基因, 其表达具有组织特异性, 并能受到NaCl, KCl, LiCl, ABA以及脱水等胁迫上调; 耐盐品种GmNHX1的转录水平在叶片中低于而在根系和下胚轴中均高于敏盐品种. 将GmNHX1 cDNA置于两个串联的CaMV35S启动子控制下在豆科模式植物百脉根中过表达, 提高了转基因百脉根的耐盐性. Na⁺及K⁺含量测定表明, 与对照相比, 过表达GmNHX1的百脉根小苗中Na⁺, K⁺含量显著降低, K⁺/Na⁺比率显著增加, 显示了百脉根中过表达GmNHX1所导致的耐盐性与减少转基因植物中Na⁺的积累有密切关系.     

一个竹类植物MADS盒基因的克隆及其在拟南芥中的表达

采用RACE方法, 从竹类植物麻竹(Dendrocalamus latiflorus)幼穗中克隆到一个含完整编码区及3′端非翻译区的cDNA, 命名为 DlMADS18. 该cDNA全长1039 bp; 编码区共编码249个氨基酸, 具有典型的植物MADS盒基因结构, 由MADS区、I区、K区和C末端组成. 序列相似性分析结果表明, DlMADS18属于AGL6亚家族, 其氨基酸序列与水稻(Oryza sativa L)的MADS盒基因OsMADS6同源性最高, 序列一致性为88%, 与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AGL6一致性为59%. 将DlMADS18置于CaMV 35S启动子控制下在拟南芥中异位表达, 转基因拟南芥表现出叶卷曲、植株矮小、开花时间提前、花聚生于花序顶端等性状, 表明DlMADS18很可能参与麻竹开花时间的调控.     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

大豆GmLls1基因的克隆及表达调控分析

玉米的叶片坏死斑点(lethal leaf-spot 1, Lls1)基因及其拟南芥中的同功能基因已证明编码叶绿素分解代谢中的关键酶脱镁叶绿酸氧化酶(pheide a oxygenase, PaO). 为了深入研究大豆叶片衰老过程中叶绿素分解代谢的调控机制, 从大豆中克隆了玉米Lls1的同源基因, 其cDNA全长1817 bp, 命名为GmLls1 (GenBank登录号: DQ154009). 序列分析表明, 该基因与拟南芥、玉米、豇豆和番茄等的Lls1及其同功能基因具有很高的同源性, 其编码蛋白含有典型的Rieske [2Fe-2S]结构域、非亚铁血红素铁结合域和C-末端CXXC基序, 这些都是PaO功能蛋白所具有的典型结构特征. RT-PCR结果显示, 在大豆叶片自然衰老、人工黑暗诱导衰老和子叶衰老3个系统中, GmLls1基因都表现出明显的衰老上调趋势. 进一步分析发现, 在因敲减类受体蛋白激酶rlpk2基因而导致衰老延缓的大豆转基因叶片中, GmLls1的表达显著下降, 而在因过表达rlpk2而导致加速衰老的转基因叶片中, GmLls1的转录本积累明显增加, 暗示RLPK2介导的信号途径可能参与调控GmLls1在大豆叶片衰老过程中的表达, 而rlpk2-RNAi转基因离体叶片光照下表现出lls1突变体典型的斑状失绿坏死表型则进一步支持了上述推论.