纳豆激酶酶学性质的初步研究

通过(NH4)2SO4对NK分级盐析浓缩,发现用饱和度为65%的(NH4)2SO4盐析,浓缩10倍,NK回收率最高,可达到87.1%.对其纤溶活性研究表明,NK在40℃以下时,纤溶活性相对稳定,65℃以上时,活性迅速下降;pH<4时,显著抑制NK活性;Mg2+对其纤溶活性有显著激活作用,Zn2+,Ca2+,Fe2+和Cu2+对NK有不同的抑制作用,而Al3+则使NK活性完全丧失.     

重组纳豆激酶的分离纯化及酶学性质的初步研究

将已构建好的表达载体pTYB102转化大肠杆菌,经IPTG诱导,表达出以可溶形式存在的有活性的纳豆激酶．首先对表达条件进行优化,最佳诱导温度是15℃,最佳诱导时间是10h．然后将离心收集到的菌体通过超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100柱层析以及冷冻干燥等步骤进行分离纯化,得到电泳纯的有溶栓活性的纳豆激酶．冷冻干燥品在SDS—PAGE上呈一条蛋白质带．纯化倍数35倍,纯酶比活1147．54．该酶的最适反应条件是45℃,pH8．0．酶活性在pH6．0～11．0,55℃以下稳定．     

纳豆激酶纯化及性质研究

以蒸煮后的大豆为原料通过纳豆菌发酵,生产纳豆激酶.改进纯化工艺以酸法提取和凝胶过滤纯化出比活性为160.8IU/mg的酶制品.该酶制品不仅对纤维蛋白有很好的溶纤作用,而且对大鼠血纤维（拟血栓）也有很好的溶纤活性,实验还证明该酶制品对大鼠新鲜血液有很好的抗凝性能,尤其是该酶制品在pH值为2.45和经胃蛋白酶作用后仍保持较高的活力.同时,该方法制备工艺简便,有0.6%的高回收率,故本方法提取的纳豆激酶制品有望开发成为新型口服溶栓、防栓制剂,以供医疗和保健应用.     

己糖激酶冻干粉的制备工艺及其酶学性质

为将发酵制备的液态己糖激酶制备成粉剂,应用于诊断试剂领域,对己糖激酶冻干保护剂进行了筛选优化;并对制得的己糖激酶干粉的酶学性质进行了研究。通过单因素试验、Plackett-Burman设计和最陡爬坡试验,以响应面分析确定其最优保护剂种类复配比例。结果表明:冻干保护剂选取蔗糖、乳糖和山梨醇效果最佳;且最优比为蔗糖4. 5%、乳糖2. 0%、山梨醇8. 0%,平均酶活保存率为78. 1%。己糖激酶干粉的最适反应温度为50℃;在45℃高温处理30 min后,仍具有60%的活力;最适反应p H为8. 0,在p H 6. 0～10. 0范围内具有较好的稳定性;为己糖激酶制剂在诊断试剂领域的应用奠定了基础。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体P184Q的酶学性质表征

通过分析谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶(AK)的结构,筛选可能影响别构抑制剂结合的Pro184位点,对其进行饱和定点突变,成功筛选出突变菌株P184Q.酶学性质研究表明:突变体P184Q的V_(max)比野生型(WT)提高了3倍;n=1.39,低于WT的值(2.6),正协同性下降,同时Km值减小,对底物的亲和力增大;P184Q最适pH=6.5,最适反应温度为25℃,半衰期为2.8h;P184Q对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性,解除抑制剂苏氨酸和甲硫氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸、赖氨酸对酶活力的抑制作用.     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体A380H的酶学性质

同源序列比对和蛋白质结构分析表明,A380为天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)的绝对保守位点,对该位点进行定点突变、分离纯化和性质表征.结果表明:与野生型(WT)相比,突变体A380H的V_(max)提高4.28倍;突变体A380H的最适温度由28℃提高至35℃,最适pH值仍为7.5,半衰期由4.5h缩短至3.5h;底物抑制剂对WT和突变体均有抑制作用,苏氨酸和赖氨酸呈协同抑制作用,苏氨酸单独存在时对A380H具有激活或抑制减弱作用;Mg~(2+),Ni ~(2+)对WT有激活作用,1,5mmol/L的Cu~(2+)对A380H有激活作用;与WT相比,甲醇和异丙醇对A380H的抑制作用增强,正丁醇和乙腈对A380H的抑制作用减弱且表现出激活作用.     

纳豆激酶液体发酵条件的优化

纳豆激酶是从日本传统食品内豆中提取出来的一种具有溶血栓功能的酶。笔者从市售纳豆中分离出一株能产纳豆激酶的菌株,并对之进行液体培养,发现在ｐＨ７．０,接种量为２％,种龄２４ｈ,装液量１０ｍＬ／１００ｍＬ,碳源为木糖,浓度为２％,氮源为大豆蛋白胨,浓度为３％的条件下,接种后第四天为产酶高峰期,最高产酶量可达到７８７．１尿激酶单位／ｍＬ发酵液。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶M372I-T379S双突变体的构建及其酶学性质

为构建高酶活力天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK), 并削弱或解除Lys(lysine)反馈抑制作用突变体, 通过定点突变和高通量筛选技术构建突变体M372I,T379S和M372I-T379S, 对野生型（WT）和突变体分别进行诱导表达、 纯化及酶学性质表征. 结果表明： 突变体M372I,T379S和M372I-T379S AK与WTAK相比, V_max分别提高了13.77,15.02,15.60倍, K_m和n值均降低； 最适pH值分别升高为8.0,8.5,8.5, 且半衰期分别延长了1.0,0.9,2.3 h； M372I-T379S AK最适温度为30 ℃, 比WT AK高2 ℃； 当浓度为1~10 mmol/L时, 突变体均削弱或部分解除了抑制剂Lys的反馈抑制作用.     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶M372I-T379S双突变体的构建及其酶学性质

为构建高酶活力天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK), 并削弱或解除Lys(lysine)反馈抑制作用突变体, 通过定点突变和高通量筛选技术构建突变体M372I,T379S和M372I-T379S, 对野生型（WT）和突变体分别进行诱导表达、 纯化及酶学性质表征. 结果表明： 突变体M372I,T379S和M372I-T379S AK与WTAK相比, V_max分别提高了13.77,15.02,15.60倍, K_m和n值均降低； 最适pH值分别升高为8.0,8.5,8.5, 且半衰期分别延长了1.0,0.9,2.3 h； M372I-T379S AK最适温度为30 ℃, 比WT AK高2 ℃； 当浓度为1~10 mmol/L时, 突变体均削弱或部分解除了抑制剂Lys的反馈抑制作用.     

纳豆激酶高产菌株产酶特点及其干燥工艺的研究

在分析菌株产酶特点的基础上,对纳豆激酶(NK)制剂的干燥技术及其保存效果进行了实验研究.结果表明,不同NK菌株的产酶特征有明显差别;冷冻干燥和静态微波真空干燥都可用于纳豆激酶的干燥处理,其中冷冻干燥适用于纳豆激酶实验室干燥,而静态微波真空干燥适用于纳豆激酶制剂的规模化干燥;同时静态微波真空干燥时温度以不超过50℃为宜,温度过高则NK活性急剧下降,而且物料颜色变黑;NK经过干燥处理后室温贮藏24个月时,NK活性仍可达到其原始酶活的80%以上,研究结果为纳豆激酶制剂的产业化开发和应用提供了实验数据.     

PCR扩增纳豆激酶基因的程序优化

研究了利用ＰＣＲ从纳豆菌基因组ＤＮＡ中扩增纳豆激酶基因的最优化条件，得到ＰＣＲ反应在本研究中的最重要的三个参数值为：模板量１０ｎｇ；Ｍｇ＾２＋浓度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ；退火温度６０℃。在这种优化程序下进行ＰＣＲ反应，获得了特异、高效和忠实的纳豆激酶基因产物。     

蟾蜍和麻蜥肝脏及肺组织中低分子蛋白的SDS-PAGE比较分析

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色法对花背蟾蜍和密点麻蜥肝脏和肺组织中的低分子蛋白质进行了分析．结果表明，花背蟾蜍和密点麻蜥的肝脏和肺组织中蛋白务带分别为21、14、23、16.二者肝脏和肺组织均有各自的特异性务带，且肝脏中蛋白务带多于肺组织．密点麻蜥肝脏和肺组织中蛋白质务带均多于花背蟾蜍．     

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.     

番茄未成熟花粉离体成熟培养及花粉蛋白质检测的初步研究

初步研究了番茄未成熟花粉离体成熟培养的可能性.从番茄花中分离出的双核早期花粉用B3液体培养基离体培养7～9d后,有1%的未成熟花粉培养成熟,并萌发出花粉管.同时,对不同时期花粉蛋白表达做了SDSPAGE分析,结果：番茄花粉在单核期出现了分子量为21.2kD,26.0kD,33.4kD,69.1kD和97.1kD的5种特异蛋白,双核期出现了分子量为11.7kD,16.9 kD,37.3kD,41.2kD和47.1kD的5种特异蛋白,萌发花粉管后出现了分子量为20.5kD,82.8kD和105.3kD的3     

超大穗小麦高分子量麦谷蛋白亚基组成分析

采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析了超大穗小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)组成及其F1代的遗传多样性。结果表明,9份超大穗小麦中共检测到7种类型的高分子量麦谷蛋白亚基,在Glu-A1位点,出现了两种亚基,null和1亚基,Glu-D1位点只有2 12一种亚基,而Glu-B1位点上亚基类型最丰富,有4种类型,尤其出现了两种新型的复合亚基组合形式7 9 8和7 9 14 15。遗传分析表明,在超大穗小麦与普通小麦杂交后代F1中,双亲的高分子量麦谷蛋白亚基呈显性遗传,且显母性遗传倾向。     

黑稻种子醇溶蛋白亚基组成分析

以9个品种的黑稻种子为材料,用SDS—PAGE方法,分析了各个品种的醇溶蛋白亚基组成。结果表明:①黑稻种子有2条共有的特征带,其分子量分别为:26.1 KDa、21.5KDa;②亚基57.2 KDa、35.0 KDa和26.1 KDa,在每个品种中都存在明显的差异。其中,汉中黑糯、云黑和龙睛2号中含有此类亚基的数目最多(3个);在乌贡1号中,此类亚基数目最少。     

毒性与无毒性织纹螺肌肉蛋白的差异分析

通过SDS-PAGE分析毒性和无毒性织纹螺肌肉蛋白的电泳图谱差异,综合比较蛋白条带的迁移率及浓度,得出:毒性织纹螺肌浆蛋白的特征条带主要为23.6 ku和35.0 ku,无毒性织纹螺的特征条带主要为22.8 ku和31.2 ku;毒性织纹螺肌原纤维的特征条带主要为38.0 ku、50.8 ku和135.0 ku,无毒性织纹螺的特征条带主要为36.9 ku和125.8 ku.结合优化样品制备、等电点聚焦程序等条件,初步建立了织纹螺肌肉蛋白的双向电泳条件,并通过双向电泳分析了毒性和无毒性织纹螺肌肉中存在的差异蛋白.     

犬钩虫(Ancylostoma caninum)不同发育时期蛋白质组分分析

为了解犬钩虫在不同发育时期蛋白质的表达情况,我们运用SDS-PAGE凝胶电泳对犬钩虫不同发育时期L3、L4和雌、雄虫的可溶性蛋白组分进行了分析,结果发现,L3期幼虫有22条蛋白带,L4期有17条蛋白带,雄虫有22条,雌虫有22条,各期既有共同的蛋白条带也有期特异性的蛋白条带.其中L3期蛋白条带较多,L3、L4期幼虫的蛋白条带和成虫的蛋白质条带有较大差别,而雄虫和雌虫之间差别很小.这可能与L3是感染期幼虫,需要分泌更多酶穿透宿主皮肤.对犬钩虫不同发育时期表达的蛋白进行分析,为进一步开展钩虫致病和期特异性抗原的免疫保护机制以及以抗原为基础的免疫学诊断研究奠定了基础.     

普通小麦热激处理后育性变化和A、T型CMS品系不育机理的初探

用普通小麦的不育系和保持系为材料,经高温处理以后,提取其线粒体多肽和可溶性蛋白做SDS-PAGE分析,发现不育系与保持系在热激后其线粒体多肽的电泳图谱均有相互趋同的现象.育性不稳定的A型繁91小麦雄性不育系在热激后有明显的可育度提高现象.育性稳定的T型细胞质雄性不育(Cytoplasmic MaleSterility,CMS)品系及其保持系经短时间热激后没有明显育性变化.由未经热激处理的对照电泳分析可见,A型不育系、T型CMS品系花粉发育到单核期向双核期转变时,其线粒体多肽较其相应保持系明显减少,表明到此时期不育系细胞的线粒体结构与功能已明显丧失.