毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸延长酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA,C20:4n-6)是合成生物活性物质类二十碳烷酸的初级底物神经组织的重要组成成分.Δ6-脂肪酸延长酶是花生四烯酸Δ6-合成途径的关键酶之一.根据已经报道的Δ6-脂酸延长酶基因序列设计引物,分别从产花生四烯酸的丝状真菌高山被孢霉ATCC16266菌株基因组和cDNA扩增得到该序列.经序列分析后,将来源于cDNA的序列连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K上,得到重组质PIC3.5K-ELO.用电击转化法将重组载体pPIC3.5K-ELO转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,在缺省培养基筛选得到毕赤酵母转化菌株pPIC3.5K-ELO.在适宜的培养条件下,添加外源底物γ-亚麻酸(GLA)和诱导物醇诱导基因表达.气相色谱分析表明该基因在毕赤酵母中得到了表达,底物GLA转化为二高γ-亚麻酸GLA),转化效率为28.91%.对Δ6-脂肪酸延长酶进行跨膜分析,表明该蛋白为具有7个跨膜域的膜结合蛋白.     

少根根霉△12-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

为探讨采用转基因的方法将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸菌株的可行性,将来自于丝状真菌少根根霉的△12-脂肪酸脱氢酶基因与毕赤酵母的胞内表达载体pPIC3.5K连接构建了重组表达载体pPICRAD12,经Sac I线性化后电击转化毕赤酵母菌株GS115获得转基因酵母菌株PICRAD12.PCR鉴定结果表明,目的基因已经整合到毕赤酵母基因组中.经甲醇诱导表达后,通过气相色谱和气相色谱和质谱连用的方法分析转基因毕赤酵母的脂肪酸成分表明,转基因毕赤酵母的亚油酸含量增加了4.5%,说明了可以通过增加△12-脂肪酸脱氢酶基因的拷贝数或者使用强启动子的方法来增加亚油酸的含量,为将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸的基因工程菌株进行了有意义的探索.     

深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

过表达RkHMGCR基因对红冬孢酵母类胡萝卜素合成的影响

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)是甲羟戊酸途径中的限速酶之一,其表达水平和催化活性会影响萜类及其衍生物的合成量.研究从红冬孢酵母YM25235菌株中克隆到一个HMGCR基因,命名为RkHMGCR.序列分析结果显示,RkHMGCR包含一个3 981 bp的开放阅读框,编码1 326个氨基酸,其编码的氨基酸序列与已报道的HMGCR同样具有保守的2个底物结合位点、2个NADP(H)结合位点和与催化活性相关的4个关键氨基酸残基,表明RkHMGCR是一个潜在的新的HMGCR基因.将RkHMGCR转回到YM25235菌株中进行过表达,分析结果显示,基因过表达使YM25235菌株中类胡萝卜素含量提高了42.21%,菌株中油脂和脂肪酸含量分别降低了28.93%和20.31%,这与部分类胡萝卜素合成和脂肪酸代谢相关基因的转录分析结果一致.研究结果可为进一步通过代谢工程手段提高产油红酵母中类胡萝卜素及其特定组分含量的研究提供参考.     

Δ^6-脂肪酸脱氢酶的系统进化分析

将已报道的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因所编码的氨基酸序列进行比较,推断它们的系统进化关系.分析结果显示的Δ6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列都具有3个高度保守的组氨酸富集区,表明它们具有共同起源,并分为原核、动物、高等植物和低等真核4个类型.推测原核类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶是所有Δ6-脂肪酸脱氢酶的共同祖先,真核类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶在后来的进化中形成更具选择优势的细胞色素b5融合蛋白.动物类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶处于真核类Δ6-脂肪酸脱氢酶的最基础分枝,其中鱼类的Δ6-脂肪酸脱氢酶可能是动物类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶通过序列改变向Δ5-脂肪酸脱氢酶进化的中间过度形式.高等植物和真菌类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶存在着共同起源,藻类和苔藓可能在高等植物和真菌类Δ6-脂肪酸脱氢酶的进化关系上扮演着重要的角色.线虫的Δ6-脂肪酸脱氢酶作为一个独立而且最基础的分枝位于低等真核单系组中,它可能是一种趋同进化的结果.     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因敲除及鉴定

以产油丝状真菌深黄被孢霉M6-22(Mortierella isabellina 6-22)为出发菌株,利用亚硝基胍诱变技术筛选到一株对潮霉素药物敏感的菌株Mortierella isabellina 6-22-4,同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因5'与3'端部分同源序列的重组质粒PD4MI6,用于对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基鼠的敲除.通过PEG/CaCl2介导的原生质体转化法,将质粒PD4MI6转化入深黄被孢霉M6-22-4菌株.转化子经潮毒素抗性选择平板筛选、分子检测获得了一个△6-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6.气相色谱分析结果显示,该突变株γ-亚麻酸特征峰消失,相应地亚油酸产量显著增加.培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6-22或M6-22-4相比均有显著改变.     

粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区克隆与表达分析

以粘性丝孢酵母BG基因为研究对象,采用PCR方法克隆出BG基因的部分CDs区片段,并用RT-PCR方法分析了BG在不同培养条件下的表达量.实验结果如下:克隆扩增获得长为570 bp,编码189个氨基酸的部分CDs区片段.通过实时荧光定量PCR方法分析粘性丝孢酵母BG基因在不同pH、C/N、温度以及培养时间下的表达量.结果显示培养温度、pH、C/N对粘性丝孢酵母BG基因表达量无显著性影响.培养时间对其具有显著性影响,呈先上升后下降的趋势,在第3 d时表达量最高且极显著高于其他培养时期.此研究为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.     

盐地碱蓬Δ~1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶基因(SsP5CS)的克隆及表达特性

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了Δ1 -二氢吡咯 -5 -羧酸合成酶基因的cDNA片段 (S .salsaΔ1 -pyrroline -5 -carboxylatesynthasegene,Ssp5CS) .Southern杂交表明SsP5CS基因在盐地碱蓬基因组中只有一个拷贝 ;Northern杂交结果表明 ,不同盐处理 (4 0 0mmol/LNaCl)时间下SsP5CS在盐地碱蓬叶中的表达量明显增加 ;同时盐胁迫条件下盐地碱蓬叶中的脯氨酸含量与对照相比显著的增加 ,并且其渗透调节能力也逐渐增强 .推测SsP5CS基因可能在保护盐地碱蓬免受盐胁迫损伤的过程中起到重要作用     

大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆与原核表达

克隆出大肠杆菌编码葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的 gcd 基因，构建了诱导型表达载体pET28a-gcd，转化大肠杆菌E. coli BL21后获得阳性克隆菌株BL21/pET28a-gcd。IPTG诱导后，经SDS-PAGE分析表明，该工程菌PQQGDH的表达量约为对照菌的18倍，约为18.2 mg/L，实现了高表达。此外，研究发现添加MgCl₂能提高PQQGDH的表达量。     

α-1,6-葡聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

根据朱黄青霉(Penicillium minioluteumHI-4)α-1,6-葡聚糖酶的基因序列,人工合成α-1,6-葡聚糖酶基因并将其插入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA,PCR和双酶切验证结果均表明成功构建了重组质粒pPICZαA-Dex.重组质粒经SacⅠ线性化后整合到毕赤酵母X33基因组中进行表达.摇瓶发酵表明,重组毕赤酵母经甲醇诱导120 h产酶活力达到最高值29.2 U/mL,SDS-PAGE结果显示在67 ku附近有明显的条带,与α-1,6-葡聚糖酶理论分子质量相符合.     

β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的克隆与表达

为研究重组β琼脂糖酶(AgaA7)基因的表达产物及其生物活性,根据GeneBank中β琼脂糖酶(AgaA7)基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体PQE30中,测序结果证明合成基因序列正确,未改变读码框.然后将此表达载体转入E.coli M15中进行诱导表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并鉴定其生物活性.结果表明:其相对分子质量约为5.0×104,与预期相符,具有生物活性.     

低能~(12)C+~(12)C反应的测量

在鲁尔大学DTL实验室4MV串列加速器上利用12C束流轰击高纯度的C靶.通过γ谱学方法测量了Ec.m.=2.10-4.75MeV12C+12C熔合蒸发反应,并导出了12C(12C,α)20Ne和12C(12C,p)23Na反应的天体物理S(E)*因子.在Ec.m.≤3.0MeV时发现新的共振.特别是在Gamow峰的高能尾部Ec.m.=2.14MeV处出现强共振峰.当T=8×108K时,这些共振使得α链的反应率比无共振情况下提高了近5倍.     

破囊壶菌Δ4-脂肪酸脱饱和酶基因5'端侧翼区域的克隆与鉴定

应用衔接头PCR(LA-PCR)技术,扩增得到约1000 bp的海洋破囊壶菌Δ4-脱饱和酶基因5’端侧翼区域的单一产物.对该产物测序,经启动子软件与序列比对分析,发现该序列(Genkbank登录号EU074209)具有真核启动子序列的基本结构特征,含有TATA盒、CAAT盒、INR等元件.将扩增得到的脱饱和酶基因5’端侧翼序列亚克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒pGlow-TOPO中,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞.荧光显微观察大肠杆菌阳性转化子发出荧光,侧翼序列含有启动子功能得到确认.     

大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因的克隆表达

大肠杆菌碱性磷酸酶是同二聚体金属酶，被phoA基因编码．采用PCR方法从大肠杆菌K12中扩增到碱性磷酸酶基因（phoA）．用限制性内切酶BamHI和HindⅢ将片段插入克隆载体pETBlue-2．该基因被重组、转化后在大肠杆菌中经IPTG诱导表达，而后进行SDS-PAGE检测及紫外吸收分析测OD410．克隆得到了phoA基因并实现了蛋白表达，碱性磷酸酶的活性提高了18，3倍，为进行组织化学、免疫印迹、突变分析等工作打下了坚实的基础．     

rcan1-1l基因的克隆和表达

从小鼠脑组织中通过总mRNA的提取、RT-PCR方法,利用pEASY-T1载体克隆出了鼠源rcan1-1l基因,并构建出了重组有rcan1-1l基因的PET21a原核表达质粒,进行了表达条件的初步摸索,这为今后研究rcan1-1l基因以及蛋白的结构与功能打下了前期实验基础.     

δ-氨基-γ-酮戊酸合成酶(ALAS)基因的克隆与原核表达

为获得ALAS的重组表达蛋白,以人肝脏组织cDNA为模板,通过PCR扩增得到ALAS全长片段并测序,成功构建了pET30a(+)-ALAS融合表达载体并转化大肠杆菌Rosetta(DE).IPTG诱导融合蛋白表达.SDS变性凝胶电泳结果显示,融合蛋白的分子量约70kDa,并且在上清液中有少量表达.经镍柱一步纯化得到His6-ALAS融合蛋白.     

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达及其生物信息学分析

克隆表达Bacillus subtilis natto HSF 1410谷氨酸脱氢酶(GDH),测定其酶活性,并阐述其体内功能。将gdhA基因克隆入pET28a质粒在E.coli BL21(DE3)中表达,用生物信息学方法探究其蛋白结构、结构域特点。经测定Bacillus subtilis natto GDH同时具有NADP~+和NAD~+依赖活性,酶活比活力分别为3.140U/mg蛋白和0.251 4U/mg蛋白。生物信息学分析结果表明gdhA基因包含一个长度为1 275bp的开放阅读框,编码424个氨基酸,蛋白分子量为47.05kDa,理论等电点为5.58,不含跨膜区域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。其三级结构表明,该蛋白在45—174位氨基酸残基形成二聚化结构域,191—424位氨基酸残基形成NAD(P)结合位域。B.subtilis natto HSF 1410与E.coli中gdhA的二聚化结构域、NAD(P)结合位域的氨基酸相似度分别为29.23%、29.27%,显著高于B.subtilis 168中gdhA的氨基酸相似度;与B.subtilis 168中gdhA蛋白空间结构相比,B.subtilis natto HSF 1410与E.coli中gdhA在空间结构上更为相似,在体内主要负责促α-酮戊二酸转化成谷氨酸。     

Reteplase基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

进行了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆,并在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中实现了胞外表达。以基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306染色体DNA为模板,通过PCR技术克隆了r-PA基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上并进行了序列测定。测序结果表明:克隆到的基因序列长1.1 kb,与已发表的Reteplase基因同源性达99.91%,其编码的氨基酸顺序一致。文中还构建了甲醇毕赤酵母分泌性表达载体pMETαA-r-PA,用PacⅠ单酶切将pMETαA-r-PA线性化后,采用电转化的方法将其导入甲醇毕赤酵母PMAD16中,PCR和表型鉴定表明,筛选到Reteplase基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上的阳性克隆。经摇瓶初步培养及以甲醇为唯一碳源诱导表达,胞外Reteplase表达水平最高达27.93mol/(s.L)。