RNA抑制技术在神经干细胞研究中的应用

神经干细胞是在神经系统中发现的一种可以再生的细胞，不仅具有自我复制能力，还可以分化为神经元、星状胶质细胞和少突胶质细胞，对研究神经退行性疾病和神经系统的发育过程产生很大的影响，因而在国际上形成了一个研究热点，但其增殖、分化乃至迁移的机制仍有待解决，RNA抑制技术是目前流行的基因沉默法，利用导入小片段核酸进入细胞，对特定基因表达的翻译阶段进行抑制，从而观察基因对细胞的影响，该文在已获得分化相关基因的基础上，利用RNA干扰(RNAi)和反义RNA(antisense RNA)法检测几个基因对神经干细胞的影响。     

同源重组在染色体DNA基因克隆中的应用方法

同源重组是生物界普遍存在的现象，从噬菌体、细菌到真核生物都有能发生同源重组的种类。如何把同源重组应用到基因克隆中成为近年来生物学家研究的热点。本文从宿主细胞的改造、重组功能的诱导、感受态细胞的制备、线性同源载体的获得及重组体的鉴定等几个方面具体叙述这种基因克隆的新方法，从分子水平上较为详尽地介绍了同源重组在染色体基因克隆中的应用、前景展望及存在的局限性。     

苏云金芽胞杆菌高效电转化方法的建立

电转化已经成为苏云金芽胞杆菌工程菌构建过程中非常重要的一种外源基因导入方法.高效率的电转化方法将加速这类研究进展.通过对培养基、培养时间、感受态细胞制备、电转化缓冲液、电压参数的优化,建立一种高效的苏云金杆菌电转化方法.苏云金杆菌生长在含有0.5 mol/L山梨醇的BHI培养基中,30℃振荡培养至OD600值达到0.6～0.8,细菌细胞经1 g/L蛋白酶K在37℃处理20 min,然后用电转化缓冲液洗涤2遍,设定电压为1 800 V,电击1次.利用该方法,pHT315质粒在苏云金杆菌中的转化效率大幅提高.     

不同转导方式及载体形式对TALENs在小鼠胚胎干细胞打靶效率的研究

通过同源重组进行小鼠胚胎干细胞基因敲除是目前应用最为广泛的基因敲除技术手段,但同源重组的效率却非常低.TALEs和FokI的剪切结构域融合的TALENs可以实现高效的基因敲除.已有报导表明,TALENs识别位点的DNA序列和长度,及间隔区的长短等条件影响TALENs打靶效率.但外源载体的导入方式及载体的形式(DNA或RNA)是否以及如何影响TALENs的打靶效率还不明确.用不同的转导方式将TALENs导入小鼠胚胎干细胞中,并检测TALENs切割识别位点的效率,实验发现Lipofectamine○R2000转染的TALENs比电转化能更高效地切割目的 DNA位点,而DNA质粒或体外转录的RNA表达的TALENs切割DNA位点的效率相近.数据表明,在应用TALENs进行基因敲除时,有必要选择合适的转导方式以提高突变效率.     

弱电磁脉冲对完整酵母及原生质体的电转化研究

电转化法 ( electrotransformation)是利用电脉冲使细胞膜形成微孔 ,造成膜的通透性瞬时增强 ,使外源基因通过膜的穿孔进入细胞 ,并插入细胞的基因组 ,从而建立起合适的遗传转化系统的一种有效的物理方法 .这种方法转化率高 ,操作简便省时 ,在生物、医学等领域应用广泛 .由于酵母是真核生物的参考模型 ,具有其他生物所不具有的优点 ,成为表达外源基因的重要工具 ,而被国内外许多研究者广泛用于电转化的研究 .许多研究者在电转化操作中 ,都是采用场强在 ( 1～ 1 0 ) k V/ cm,脉宽数 1 0 μs～ms量级的单个或数个强脉冲电场作用于细胞 ,从而…     

响应面法优化乳酸乳球菌电转化效率研究

乳酸乳球菌NZ9000是乳酸菌食品级高效蛋白表达系统中使用最广泛的宿主菌株。为获得高效的电转化效率,首先采用单因素试验,对影响NZ9000电转化效率的各因素:生长阶段、甘氨酸浓度、质粒浓度、电场强度、复苏培养和复苏时间进行优化;然后利用响应面法对其中的关键因素进一步优化,确定最佳电转化条件为吸光值OD600 0.2,甘氨酸浓度8 g/L和电场强度12.5 kV/cm,电转化效率达到3.76×10~7 CFU/μg DNA,比优化前提高了250%。本研究通过优化乳酸乳球菌NZ9000感受态的制备方法,提高了电转化效率,为深入挖掘乳酸乳球菌感受态潜力奠定了基础。     

透明颤菌血红蛋白基因在苏云金杆菌中的表达

采用大肠杆菌与枯草杆菌的穿梭质粒pMK4作为载体,构建了含有果聚糖酶基因(sacB)启动子和vgb基因的重组质粒pMK-SV.通过原生质体和电转化,将pMK-SV转入苏云金杆菌中,经影印筛选得到转化子Bt4.对Bt4诱导表达,与原菌株相比Bt4的生长量增加了20.2%.     

单核细胞增多症李斯特菌InlC基因缺失株的构建与鉴定

为探讨单核细胞增生性李斯特菌(Lm)InlC基因在Lm致病性中的作用,本研究对其进行缺失。以单核细胞增多症李斯特菌4b血清型临床分离株LM-90SB2DNA为模板,扩增出用于缺失InlC基因的上、下游同源臂。运用SOE-PCR技术,将上、下游同源臂融合扩增得到△InlC基因缺失片段。将△InlC基因缺失片段与自杀性质粒p KSV-7连接,构建p KSV7-△InlC质粒。电转p KSV7-△InlC于LM-90SB2感受态细胞中,经过10μg/m L氯霉素和41℃下连续传代15代,获得单交换重组株,然后在41℃氯霉素中传至第108代,获得双交换重组株,菌液用旁侧引物进行PCR鉴定,然后30℃无氯霉素条件下连续传代培养30代丢失自杀性质粒并检测其遗传稳定性。结果显示:获得LM90SB2-△InlC缺失突变株,旁侧引物扩增只有1条1480 bp大小的片段,同时,对缺失片段进行测序验证,结果表明成功对InlC基因进行了缺失,并且缺失株遗传稳定。LM90SB2-△InlC的构建为进一步研究InlC基因在LM毒力中的作用奠定了基础。     

短小芽孢杆菌遗传操作系统的建立及应用

短小芽孢杆菌SCU11产生的胞外碱性蛋白酶具有良好的生皮脱毛效果,在生物制革领域有很大的应用前景.但该菌株的遗传转化系统尚未建立起来,限制了菌株的遗传改造和基因功能研究等方面的工作.本研究采用高渗透压电转化法,实现了对短小芽孢杆菌的电转化;在Ebuffer配方为甘露醇1M,山梨醇0.5M,甜菜碱7.5%,甘油10%,电场强度24KV/cm条件下,转化效率为3.5×10~3 CFU/μg DNA.构建了E.coli-Bacillus穿梭载体pUCETs,建立了短小芽孢杆菌基因敲除体系,利用该系统成功敲除了基因组中的peptidaseC40基因.本研究所建立的电转化系统及基因导入/敲除体系,为短小芽孢杆菌基因组编辑奠定了基础.     

液态空气储能与液态CO2储能技术对比

为了解决压缩空气储能储气室容积大、成本高的问题,液态空气储能和液态CO₂储能得到了国内外广泛关注及研究。针对这两大储能系统,借助ASPEN PLUS软件搭建了热力学物理模型,并借助?分析对两大储能系统进行热力学和关键参数敏感性研究分析。研究表明：液态空气储能系统?损失主要发生在压缩机及蓄热蓄冷装置上,分别占比45.02%、37.61%。液态CO₂储能系统?损失主要发生在低温膨胀机、压缩机及蓄冷蓄热装置上,分别占比26.99%、23.88%、30.41%。从电-电转化效率方面：在绝热条件下,两大储能系统由于在充放电过程能量消耗大,电-电转化效率都低于55%,相比液态空气储能,液态CO₂储能效率高。从系统成熟度方面：液态空气储能已得到工程应用,而液态CO₂储能还处于研究阶段,未得到工程化应用。从投资成本方面;液态CO₂储能单位千瓦投资成本高于液态空气储能约40%。