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微生物的腈水合酶是催化丙烯腈生成丙烯酰胺的重要生物催化剂,广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。通过PCR扩增得到诺卡氏菌的腈水合酶基因。实验先构建得到BL21-pGEX-4T-1/NHase重组菌,表达GST-NHase融合蛋白。由于GST的相对分子质量较大,阻碍了腈水合酶的β亚基与α亚基的正确结合,从而使腈水合酶表现不出酶活。于是又构建了BL21-pET-30c/NHase重组菌,IPTG诱导表达结果显示,腈水合酶α亚基基本没有得到表达,影响了腈水合酶的活性。经生物信息学分析发现,腈水合酶α亚基的起始密码子为gtg,可能不易被大肠杆菌的RNA聚合酶识别,于是通过点突变将gtg替换成atg,阳性重组子经IPTG诱导表达,结果显示腈水合酶β亚基和α亚基的表达量都有所提高。诱导表达的菌液经超声破碎,离心得到粗酶液,用EPI-30-ARG-IDA-Co2+亲和载体纯化带6×His tag的腈水合酶,气相色谱法检测腈水合酶的酶活达到200 U/mL。 相似文献
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本文通过出发菌株Nocardia.sp.163摇瓶发酵96h后分别向发酵液中间歇加入丙烯腈和催化生成高浓度丙烯酰胺分别对菌丝的毒害和耐受作用以及发酵液中残存菌丝涂布平板置于18℃低温培养成单菌落,筛选到一株比出发菌株Nocardia.sp.163相对腈水合酶晦活提高了76%的24号优良菌株.该菌株在催化腈水合生成丙烯酰胺的反应中,产酰胺酶酶活性比出发菌株降低了近50%;丙烯酰胺水溶液的电导率比出发菌株降低了45%,反应次数提高了3.33次,丙烯酰胺放料浓度提高了5.93%. 相似文献
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