Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达及快速纯化

来源于Pyrococcus furiosus COM1菌的Pfu DNA聚合酶具有保真性高、延伸速度快、热稳定性强等特点,能够提高PCR反应过程中的扩增效率,减少错误碱基掺入率.以大肠杆菌Rosetta(DE3)为重组细胞,利用一种快速表达纯化方法,让Pfu DNA聚合酶的表达纯化过程变得更加简便,并维持其高活性.结果表明,Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中能够进行大量表达,同时60℃高温水浴能有效去除杂蛋白,简化纯化步骤及提高Pfu DNA聚合酶纯度.经过一系列纯化步骤处理后,Pfu DNA聚合酶仍然能够保持较好的酶活,且在100μL PCR反应体系中,加入4μL的1 mg/mL Pfu DNA聚合酶液效果最佳.     

AEP环化酶的高效原核诱导表达与活性检测体系的建立

天冬酰胺内切酶(AEPs)可催化短肽形成结构异常稳定的环肽,其具有药物设计框架的应用前景.将来源于白花蛇舌草(Oldenlandia affinis)中AEP(Oa AEP1b)环化酶(cyclase)基因采用融合标签表达的策略在大肠杆菌菌株BL21中进行诱导表达,并比较了不同的融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP),N-utilization substance A(NusA),小泛素修饰蛋白(SUMO),绿色荧光蛋白(GFP)以及泛素(ubiquitin)对AEP环化酶表达量的影响.结果表明,MBP标签对AEP的表达促进作用最强,达到(3. 6±0. 05) mg/L,是目前文献报道的2倍.体外酶切实验证实该环化酶可对融合表达的底物蛋白MBP-Kalata B1-6*His-GST进行有效切割,但连接反应过程有待验证.本研究对AEP环化酶进行肽工程研究与应用奠定了较好的基础,并提供了一套高效的研究工具.