重排NAD+合成途径提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性

为提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的催化活性,构建了两个载体分别表达:(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC);(2)与NAD+合成相关的关键酶,包括烟酸转磷酸核糖激酶(pnc B)、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(nad D)和NAD+合成酶(nad E)。将这两个载体共转化大肠杆菌,获得重组菌E.coli(p ET-pepcp UC-pnc B-nad D-nad E)。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示这些酶均实现了高表达。摇瓶发酵显示,与单独过表达PEPC的重组菌相比,双质粒工程菌的PEPC酶活提高了4.36倍;与野生型大肠杆菌相比,双质粒工程菌的琥珀酸产量提高了4.23倍,达到0.9 g/L,富马酸产量提高了5.23倍,达到5.4 mg/L。上述结果表明加强NAD+合成途径提高了PEPC活性,并增加了还原三羧酸循环的代谢流量。     

三种不同磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆、表达及其对宿主菌生长的影响

应用PCR技术分别克隆了集胞藻6803、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因,构建重组大肠杆菌。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,来自集胞藻6803和大肠杆菌的PEPC实现了高效表达,而来自鲍曼不动杆菌的PEPC表达较弱,提示密码子偏好性的影响。前两菌提前进入对数生长期,来自鲍曼不动杆菌PEPC工程菌却延迟生长,但这3种重组菌发酵24h后的生物量与对照菌几乎相同。如果排除质粒复制造成的代谢负荷,过表达PEPC促进了宿主菌的生长,推测是因为重排了代谢流量。     

基于响应面模型的滑移门动力学特性多目标优化

为了在满足开启轻便性的条件下提升滑移门的运动平顺性,提出了基于响应面模型的滑移门动力学特性多目标优化方法.基于刚柔耦合多体动力学方法建立某MPV车型的滑移门模型,对其运动平顺性及开启轻便性的评价指标进行分析,并通过滑移门台架试验验证了该仿真方法的可靠性.对滑移门运动机构进行参数化设计,结合拉丁超立方采样法进行试验设计,通过对滑移门动力学特性指标进行灵敏度分析,得到了结构参数对性能的影响规律.建立精度可靠的滑移门动力学特性二阶响应面模型,各项指标的复相关指数R2均高于0.9.采用NSGA-Ⅱ遗传算法对滑移门运动机构进行多目标优化,滑移门中导向轮载荷峰值与质心加速度峰值分别降低39%和24.4%,全开所需时间低于1.8 s,在满足开启轻便性要求的同时,显著提升了滑移门的运动平顺性.