巴西苏木素致死膀胱癌靶标基因siRNA的筛选

课题组前期工作表明GADD45β和c-Fos在巴西苏木素(Brazilin)致死膀胱癌细胞T24时显著升高,且分别过表达GADD45β和c-Fos均能抑制T24细胞的生长,表明其为Brazilin致死T24细胞潜在的靶标基因,但并未在GADD45β和c-Fos沉默状态下研究Brazilin对T24细胞的影响。RNA干扰是目前沉默靶标基因的常用技术手段,但高效RNAi片段筛选步骤繁琐,成本高。在本文中,首先以GADD45β为例,设计仅需一步酶切连接就可获得的荧光报告载体p-GADD45β-EGFP-N1,对GADD45β的3条siRNA(siRNA360、siRNA477和siRNA638)在荧光显微镜下进行干扰效率的检测,获得的干扰效率分别为63%、34%和67%,表明siRNA638对GADD45β干扰效率最高,与RT-qPCR的筛选结果一致。为验证荧光报告载体的通用性,选择c-Fos构建荧光报告载体p-c-Fos-EGFPN1,通过筛选获得荧光量最少的c-Fos siRNA274组的干扰效率最高为64%,与RT-qPCR的验证结果一致。     

HO-1超表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞的影响

血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)的表达与肿瘤的生长、凋亡和增殖有密切关系。课题组前期的数字基因表达谱结果显示,巴西苏木素处理膀胱癌T24细胞后,HO-1表达显著提高,提示其可能在这一过程中发挥重要作用。为进一步研究HO-1对T24细胞的影响及其是否为巴西苏木素作用于T24细胞的靶标基因,利用Real-Time quantitative PCR(qPCR)验证巴西苏木素处理T24细胞后HO-1基因表达量的变化,克隆HO-1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-HO-1,将该载体转染T24细胞,MTT法检测HO-1超表达后T24细胞的活性变化。结果显示,HO-1在巴西苏木素处理T24细胞12h后显著上调2.2倍;HO-1成功转入T24细胞中后,mRNA表达显著提高93.3%,细胞活性略有升高。上述结果表明HO-1的高表达对T24细胞有保护作用,HO-1不是巴西苏木素作用于T24细胞的靶标分子,其在巴西苏木素处理T24细胞时表达升高可能是由于药物作用后,细胞为了逃避凋亡而产生应激反应所引起的。     

四环素基因调节系统下小鼠VEGF基因表达效率的测定

为了测定四环素基因调节小鼠模型的有效性和潜在的应用价值,针对各组织中VEGF mRNA表达水平受四环素调节的效率进行了分析.从小鼠不同组织提取总RNA,进行realtime PCR分析,并利用相对定量2-△△CT方法分析这些组织中VEGF基因在mRNA表达水平上的差异,同时观察和统计小鼠组织发育情况.结果表明,转基因小...     

GADD45β过表达抑制膀胱癌细胞T24的增殖

GADD45β(growth arrest and DNA damage,GADD)在肿瘤的发生、发展以及凋亡过程中起着重要作用。首先利用Real-time quantitative(qPCR)检测到32μg/mL巴西苏木素处理人类移行膀胱癌T24细胞6h后,GADD45β的mRNA水平显著上调2.7倍。为了研究GADD45β在巴西苏木素致死T24细胞中的作用,从T24细胞的cDNA中扩增获得GADD45β基因全长读码框,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构成重组载体pcDNA3.1-GADD45β。将该真核表达载体转染T24细胞,发现GADD45β在mRNA水平的表达显著上调,表明真核表达载体成功转入T24细胞;观察GADD45β过表达后对肿瘤细胞的影响,发现细胞变圆,贴壁性变差,活性显著降低85%。本研究表明GADD45β在T24细胞中的过表达能有效地抑制细胞生长,对细胞有较强的致死作用。