耐热碱性磷酸酯酶(TAPND27)的表达、纯化和性质测定

通过分离纯化和酶学性质测定,确定耐热碱性磷酸酯酶（ＴＡＰＮＤ２７）为八聚体,最适反应温度为６５℃,在９９℃保温３０ｍｉｎ仍保留４９．４％的活性,在质量分数为５％的Ｔｗｅｅｎ２０体系中依然有７０％以上的酶活性,并且有很宽的ｐＨ稳定范围。这表明ＴＡＰＮＤ２７适合在高温条件和高浓度去污剂的体系中应用。     

应用多波长反常散射法测定耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的晶体结构

运用基因工程技术，将耐热邻苯二酚2，3－双加氧酶（TC23O）分子中的甲硫氨酸（Met）全部置换为甲硒氨酸（SeMet）。培养出甲硒氨酸置换的耐热邻苯二酚2，3－双加氧酶（SeMet-TC23O）的晶体，利用同步辐射光源收集了SeMet-TC23O晶体的X射线衍射数据，应用多波长反常散射方法测定了TC23O0.3mm的晶体结构。结果显示，TC23O分子为同源四聚体结构，每个单体由相对独立的N－端结构域（1－153位氨基酸残基）和C－端结构域（153－319位氨基酸残基）构成。每个结构域含有两个在此类酶中具有特征性的βαβββ结构花样，两个结构域可根据分子内非晶体学对称轴近似叠合。     

耐热碱性磷酸酯酶基因的DNA序列分析

从栖热菌中克隆到产耐热碱性磷酸酯酶（FD－TAP）基因并进行了DNA序列分析,结果表明此2．0kb的片段含有一个1056bp的开放阅读框,编码501个氨基酸的蛋白质,其N端有一26个氨基酸的信号肽．在起始密码子的上游5bp处有一个5＇－GGAGGT－3＇的SD序列．基因编码区的（G＋C）％为68．7％,第3位密码子（G＋C）％为92．7％．FD－TAP的氨基酸序列与大肠杆菌等生物的碱性磷酸酯酶氨基酸序列比较,相同性为27％,相似性为38％．中央β－折叠区及与活性中心相关的氨基酸残基高度保守．表明FD－TAP具有与大肠杆菌碱性磷酸酯酶相似的结构和作用机制．在相当于大肠杆菌碱性磷酸酯酶的His370至His412两个金属离子结合部位之间,FD－TAP有一72个氨基酸的插入片段,提示该插入片段与FD－TAP的高耐热性相关．     

耐热碱性磷酸酯酶(FD-TAP)的三维结构分析

有计算机图像模拟,能量极小化和分子动力学方法,以大肠杆菌碱性到酯酶（ＢＡＰ）为主要结构模板,构建了耐热碱性到酯酶（ＦＤ－ＴＡＰ）的三维结构,并分析了它的结构特征,从而为酶蛋白的结构、催化反应活性和热稳定性间关系的进一步研究打下了很好的基础。