裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512细胞油脂的研究

裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512是高产二十二碳六烯酸(DHA)的一株海洋真菌,其细胞内油脂占细胞干质量的18.3%.细胞油脂的总脂肪酸组成为45.7%DHA,12.5%DPA和41.8%棕榈酸.总油脂由26.4%极性脂和73.6%中性脂组成.薄层色谱、高效液相色谱及质谱分析表明该菌株还能合成强抗氧化剂虾青素.采用均匀设计获得高产DHA的最优培养基(g/L):葡萄糖109.7,蛋白胨19.2,酵母膏20.0,海水晶10.4,DHA产量高达2.10 g/L.     

不同丝状真菌Delta-12脱饱和酶的生物信息学比较分析

运用生物信息学方法对卷枝毛霉、稻根霉菌、高山被孢霉和米曲霉等丝状真菌的Delta-12脱饱和酶的氨基酸组成、理化性质、氨基酸保守位点、进化关系、信号肽、跨膜结构。亲水性/疏水性和二级结构等进行比较分析.结果表明:丝状真菌Detal-12脱饱和酶是一种亲水的稳定的膜结合蛋白,不具有信号肽,具有明显的疏水跨膜区域,有3个保守的His-box功能区域,二级结构主要由螺旋和不规则卷曲构成,其中螺旋占50%以上.     

环孢菌素A产生菌的分子鉴定及其原生质体制备

环孢菌素A高产菌株No.421502经形态学特征和分子标记鉴定,确认为镰孢菌属,命名为Fusariumsp.No.421502.收集Fusarium sp.No.421502孢子刚萌发的幼嫩菌丝体,以0.7 mol/L KCl为渗透压稳定剂,用质量浓度为20 mg/mL的蜗牛酶,30℃80 r/min处理5 h制备原生质体.原生质体为7×105/mL,原生质体形成率为62.8%.制备的原生质体稀释后接入再生培养基,再生率为29.6%.     

扩展青霉(Penicillium expansum)PF898基因组DNA提取方法的比较

利用CTAB法、SDS改进法和SDS快速法3种DNA提取代表性方法,对扩展青霉(Penicillium expansum)PF898基因组DNA的提取进行比较研究.CTAB法提取的DNA样品纯度最高,SDS裂解法制备的DNA得率最高;CTAB法和SDS改进法所得DNA都可直接应用于限制性酶切分析;3种方法所提取的DNA均能满足扩展青霉PF898脂肪酶基因和18S rRNA的PCR扩增.总体而言,SDS法简便、快速、得率高,是一种理想的扩展青霉基因组DNA提取方法.     

破囊壶菌△^4-脂肪酸脱饱和酶基因5’端侧翼区域的克隆与鉴定

应用衔接头PCR（LA-PCR）技术,扩增得到约1000bp的海洋破囊壶菌△^4-脱饱和酶基因5’端侧翼区域的单一产物。对该产物测序,经启动子软件与序列比对分析,发现该序列（Genkbank登录号EU074209）具有真核启动子序列的基本结构特征,含有TATA盒、CAAT盒、INR等元件。将扩增得到的脱饱和酶基因5’端侧翼序列亚克隆到含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的质粒pGlow-TOPO中,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞。荧光显微观察大肠杆菌阳性转化予发出荧光,侧翼序列合有启动子功能得到确认。     

高产DHA海洋真菌Thraustochytrium sp.N4-103脂肪酸组成及其18S rRNA基因的克隆与序列分析

采用松花粉垂钓法分离到一株docosahexaenoic acid(DHA)高产菌Thraustochytrium sp．N4-103．该菌株细胞油脂的脂肪酸组型为47．3％DHA，11．6％C22：5(n-6)，9．4％C20：5(n-3)，9．1％C20：4(n-6)和22．6％C16：0；单细胞油脂由42．6％极性脂肪，45．3％中性脂肪和12．1％糖脂组成．细胞生长与DHA合成的最佳务件：碳源为葡萄糖，氮源为酵母膏，温度为25℃。利用PCR技术分离得到N4-103菌株18S rRNA基因并进行了克隆测序，序列含有Thraustochytrids的特征插入片段．依据18S rRNA基因序列所构建的遗传进化树表明该菌是一株与Thraustochytrium sp．KK17-3具有紧密亲源关系的未报道的破囊壶菌。     

脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶在酿酒酵母中共表达

为了利用转基因技术在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中生产二十二碳六烯酸(DHA,22∶6Δ4,7,10,13,16,19n-3),构建了同时含C20-Δ5脂肪酸碳链延长酶(TFD5)和C22-Δ4脂肪酸碳链脱饱和酶(FAD4)基因的共表达质粒pYTFD5-FAD4.该质粒是通过基因重组的方法,使脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶基因置于各自启动子和终止子下获得的.共表达质粒pYTFD5-FAD4转化酿酒酵母所得到基因工程菌,在添加终质量分数为2%的半乳糖,终体积分数为1%的NP-40和0.3 mmol/L的底物二十碳五烯酸(EPA,20∶5Δ5,8,11,14,17n-3)下进行诱导,可直接转化二十碳五烯酸(EPA,20∶5Δ5,8,11,14,17n-3)生成二十二碳五烯酸(DPA,22∶5Δ4,7,10,13,16n-3)和二十二碳六烯酸(DHA,22∶6Δ4,7,10,13,16,19n-3).     

伯克霍尔德菌ZYB002胞外脂肪酶的分离纯化及其酶学性质分析

伯克霍尔德菌ZYB002胞外脂肪酶发酵上清液经冻干、透析、DEAE Sepharose Fast Flow层析柱和Sephadex G-75层析柱等步骤纯化后,获得电泳纯的脂肪酶.纯化后的脂肪酶分子质量为33 ku,水解棕榈酸对硝基苯的比活力为1 902.5 U·mg-1.脂肪酶催化水解反应的最适温度和最适pH值分别为50℃和8.5;在30~65℃和pH 3.0~10.0的范围内保持相对稳定.脂肪酶对烷烃、非离子型表面活性剂等有机溶剂具有较好的耐受性.在最适条件下,脂肪酶水解pNPP的Km和Vmax分别为3.79 mmol·L-1和714.29μmol·mg-1·min-1.     

破囊壶菌Δ4-脂肪酸脱饱和酶基因5'端侧翼区域的克隆与鉴定

应用衔接头PCR(LA-PCR)技术,扩增得到约1000 bp的海洋破囊壶菌Δ4-脱饱和酶基因5’端侧翼区域的单一产物.对该产物测序,经启动子软件与序列比对分析,发现该序列(Genkbank登录号EU074209)具有真核启动子序列的基本结构特征,含有TATA盒、CAAT盒、INR等元件.将扩增得到的脱饱和酶基因5’端侧翼序列亚克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒pGlow-TOPO中,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞.荧光显微观察大肠杆菌阳性转化子发出荧光,侧翼序列含有启动子功能得到确认.