基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立

目的 构建基于Cre- LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法 首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、 Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导入C57BL/6 J小鼠囊胚,移入同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠。再将杂合子hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasfl/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg (EIIa-cre)小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平。结果 成功构建了基于Cre- LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率>50%的雄鼠与野生型C57BL /6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasfl/fl小鼠与Tg (EIIa-cre)工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.5～15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达。结论 成功建立运用Cre- LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲入小鼠模型做好技术储备。     

4种不同处理的实验动物饮水储存时间-细菌培养报告

目的通过模拟现实环境,对国家药物安全评价监测中心可能使用的4种处理动物饮水的储存时间-菌落进行监测,为该中心的实验动物饮水管理提供参考。方法将4种水样存放在模拟现实环境下,每周分别取样接种血平皿进行细菌培养,为控制样品传递可能造成的污染,取样及接种操作安排在临近储存环境的设备中进行。结果高压灭菌管道自来水连续5周未检测到细菌,高压灭菌过滤水连续8周未检测到细菌;新鲜未高压灭菌管道自来水及过滤水水样细菌检出阳性,其中新鲜自来水存放1周后每毫升水样中菌落单位超过100个,新鲜过滤水存放1周后每毫升水样中菌落单位平均34个（范围：29～37 cfu/mL）。结论高压灭菌水储存5周满足无菌要求,可提供给清洁级以上动物饮用;未经高压灭菌过滤水储存1周内可满足国标要求,可供普通级动物使用,但接取新鲜水样将更加安全;新鲜管道自来水满足国标要求,可供普通级动物使用,但建议不要储存过夜饮用。     

玉米芯垫料替代刨花垫料后动物的换窝频度

本研究目的在于考察不同材质的动物垫料对动物排泄物的吸收程度,为采用玉米芯垫料取代传统刨花垫料后,在动物管理中设计垫料更换频度提供参考数据。研究选用初始均重分别约500 g(n=72)和200 g(n=24)的2批次SD大鼠及1批均重约35 g(n=24)的BALB/C小鼠,在动物笼具内动物数量及铺垫垫料厚度不同时,通过测定动物笼具内氨浓度值、垫料吸湿性能、垫料和动物皮毛洁净度评分等参数对两种垫料进行评估。结果表明,在使用相同体积(厚度)垫料的情况下,玉米芯垫料可以获得比柳木刨花垫料更好的吸水和氨吸附能力,从而可以减少垫料更换频率。     

药物安全性评价研究中犬和猴的眼科学检查方法

系统介绍了犬和猴的实验室眼科学检查方法。主要内容包括针对猴或犬选取合适的保定方式,肉眼对动物眼外观检查,使用裂隙灯对动物眼前节检查,动物散瞳后使用检眼镜观察眼后节,并说明检查操作中的注意事项。     

高效切割Hipp11 敲入位点的sgRNA 设计及活性验证

摘要: 目的设计并验证能够高效切割Hipp11 位点的sgRNA,为在Hipp11 位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11 位点的sgRNA 进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9 活性检测试剂盒在体外检测sgRNA 的活性。选取活性较高的sgRNA 体外转录,与Cas9 mRNA 一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11 位点切割效率,计算出sgRNA 的体内活性。结果两个sgRNA 的体外活性分别为19. 2%和51. 7%,使用体外活性高的2 号sgRNA 显微注射获得8 只新生小鼠,其中62. 5% ( 5 /8) 的小鼠中检测到Hipp11 位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11 位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR 技术在Hipp11 位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA 体外活性能够预测sgRNA 在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA 的有效手段。     

功能单体对苯乙烯-丙烯酸丁酯乳液共聚物黏弹性能的调控作用

在苯乙烯-丙烯酸丁酯乳液聚合中,加入少量功能单体甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)(两者的质量分数小于6.0%)参与共聚,采用差示扫描量热仪(DSC)、动态机械分析仪(DMA)以及旋转流变仪对聚合物的黏弹行为进行研究,并分析了聚合物黏弹行为变化的机理。结果表明:随着功能单体用量增加,聚合物的玻璃化温度、储能模量、黏度等整体呈上升趋势,当m(MAA)∶m(HEMA)为0.5∶4.1以及1.2∶2.5时,黏弹行为变化显著。凝胶渗透色谱(GPC)结果表明,黏弹行为变化的主要因素并非由聚合物相对分子质量及其分布变化引起。通过2组聚合物在乙酸乙酯中的溶解实验,发现了凝胶现象,FT-IR图谱证明此凝胶是由不同类型的氢键作用引起的,这也是导致聚合物黏弹性急剧变化的主要原因。     

实验动物兽医在药物安全评价实验中的职能作用

随着公众和使用实验动物的机构对实验动物伦理福利关注度的提升,实验动物兽医在药物安全评价实验室中的作用的重要性逐渐突显出来。实验动物兽医究竟应该在药物安全评价中承担什么样的职能与角色呢?本文从机构职能设置和实验开展这两个方面展开叙述回答了这一问题。完整的兽医职能首要是保证所使用的动物质量符合标准,并能达到实验的要求;对全体员工进行专业培训和指导;为机构的员工职业健康计划出谋划策;作为机构IACUC成员参与其运转;药物安全评价实验中的兽医,必须保证提供高标准的兽医护理和福利,以支持安全性评价团队收集到可靠的数据。