谷胱甘肽合成酶系基因协调表达体系的构建

通过 PCR获得 E.coli B谷胱甘肽合成酶系基因 ( gsh I,gsh II)片段 ,结合定点突变稀有起始密码子 ,设定 gsh I与 gsh II位置与距离 ,构建双顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I- gsh II,建立GSHI、GSH- II蛋白表达体系。结果表明 :以 0 .0 8mmol/L IPTG于 2 8℃诱导工程菌 E.coli BL2 1( DE3) ( p Trc99A/gsh I- gsh II) ,GSH- I、GSH- II蛋白比为 4.5∶ 1 ( m∶ m)时谷胱甘肽合成能力最高 ,达到每克湿菌体 8.5 mg。通过构建单顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I、p Trc99A/gsh II测定GSH- I与 GSH- II蛋白的最适配比 ,结果表明 :在 GSH- I、GSH- II蛋白总量恒定的情况下 ,要提高谷胱甘肽产率 ,两者比例以 3∶ 1～ 6∶ 1为宜     

重组大肠杆菌催化合成谷胱甘肽的研究

利用PCR技术扩增编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)及谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)的基因，并进行了部分序列分析，分别构建了表达质粒pTrc—gshI和pTrc—gshⅡ，它们在E．coliBL21中的稳定性很好。在E．coliBL21(pTrc—gshI)：E．coliBL21(pTrc—gshⅡ)-3：1的情况下，谷胱甘肽的合成达3．31g／L，高于工程菌E．coliBL21(pTrc—gsh)催化合成的谷胱甘肽的量(2．51g／L)。利用E．coliBL21(pTrc—gshI)与E．coliBL21(pTrc—gshⅡ)将γ-谷氨酰半胱氨酸的合成与谷胱甘肽的合成分步进行，谷胱甘肽的合成达3．78g／L，比利用E．coliBL21(pTrc—gsh)采用两步法合成的谷胱甘肽高42．1％，解决了GSH对GHI的反馈抑制，并降低了ADP对第二步反应的抑制程度。