基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立

目的 构建基于Cre- LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法 首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、 Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导入C57BL/6 J小鼠囊胚,移入同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠。再将杂合子hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasfl/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg (EIIa-cre)小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平。结果 成功构建了基于Cre- LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率>50%的雄鼠与野生型C57BL /6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasfl/fl小鼠与Tg (EIIa-cre)工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.5～15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达。结论 成功建立运用Cre- LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲入小鼠模型做好技术储备。     

B6-Trp53tm1 /NIFDC 小鼠在MNU 给药后的体质量、脏器质量、血液学及血生化指标的测定

摘要: 目的测定自主建立的p53 + / － 基因敲除小鼠( B6-Trp53tm1 /NIFDC) 在N-甲基-N-亚硝基脲( N-Methyl-Nnitrosourea,MNU) 给药后体质量、脏器质量、血液学及血生化指标,为临床前药物安全评价致癌性实验短期体内替代试验候选遗传修饰动物模型提供背景性数据。方法共设计4 个组: 阴性对照组( 野生型小鼠) 给予生理盐水、溶媒对照组( B6-Trp53tm1 /NIFDC 小鼠) 给予枸橼酸缓冲液、MNU 组1 ( B6-Trp53tm1 /NIFDC 小鼠) 给予75 mg /kg MNU、MNU 组2( 野生型小鼠) 给予75 mg /kg MNU,阴性对照组和MNU 组2 每组野生型小鼠各20 只,雌雄各半,溶媒对照组和MNU 组1 每组B6-Trp53tm1 /NIFDC 小鼠各20 只,雌雄各半,测定其体质量、主要脏器质量、相对脏器质量、血液学及血生化指标,并进行统计分析。结果MNU 组1、MNU 组2 动物体质量降低与阴性对照组、溶媒对照 组相比都存在显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) 。MNU 组1、MNU 组2 动物心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胸腺和颌下腺的绝对质量与阴性对照组、溶媒对照组相比有显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) 。MNU 组1 和MNU 组2 动物心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺和颌下腺的相对质量与阴性对照组、溶媒对照组相比有显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) 。MNU 组1 和MNU 组2 动物均发现NEU、LYM%、LUC%、ＲBC、HGB、HCT、MCV、MCHC、ＲDW、HDW、CHCM、CHDW、PDW、MPV 及PLT 等15 个指标与阴性对照组和溶媒对照组相比有显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) 。另外,MNU 组1 和MNU 组2 均发现TP、ALB、CＲEA、UＲEA、TCHO、TG、CA 等7 个指标与阴性对照组和溶媒对照组有显著性统计学差异( P ＜ 0. 05) ,MNU 组2 的AST 与阴性对照组和溶媒对照组有显著性升高( P ＜ 0. 05) ,但MNU 组1 和MNU 组2 组间没有显著性统计学差异。结论本文测定并分析了自主建立的p53 + / － 基因敲除小鼠( B6-Trp53tm1 /NIFDC) 和野生型小鼠分别给予MNU 及枸橼酸缓冲液后的体质量、脏器质量、血液学及血生化指标,该模型有望将来用于临床前药物安全评价致癌性实验短期体内替代试验。     

p53+ /－ 基因敲除小鼠的脏器质量及血液学参数测定

摘要: 目的测定自主建立的p53+ /－ 基因敲除小鼠的脏器及血液生理生化指标,并比较周龄、性别对各项指标的影响。方法选取4 周龄和8 周龄的p53+ /－ 基因敲除小鼠各20 只,雌雄各半,测定其主要脏器质量及血液生理指标。结果不同周龄和性别的p53+ /－ 基因敲除小鼠部分脏器质量和血生理生化有差异性。4 周龄和8 周龄小鼠在体质量等这21 项指标上都有差异显著性( P ＜ 0. 01) ,且在左肾上腺等8 项指标上差异存在统计学意义( P ＜ 0. 05) 。4 周龄的雌、雄小鼠在ＲDW、总胆固醇( CHO) 这2 项指标上差异存在显著性( P ＜ 0. 01) ,仅肺这1 项指标上差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) ,其余指标之间无明显差异; 而8 周龄雌雄小鼠在体质量等16 项指标上雌雄间都有显著性差异( P ＜ 0. 01) ,在HCT 等9 项指标上存在差异( P ＜ 0. 05) 。结论本文测定并比较了不同周龄及性别的p53+ /－ 基因敲除小鼠的脏器及血液生理生化指标,为该模型的合理利用及商业化供应提供了背景数据。     

高效切割Hipp11 敲入位点的sgRNA 设计及活性验证

摘要: 目的设计并验证能够高效切割Hipp11 位点的sgRNA,为在Hipp11 位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11 位点的sgRNA 进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9 活性检测试剂盒在体外检测sgRNA 的活性。选取活性较高的sgRNA 体外转录,与Cas9 mRNA 一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11 位点切割效率,计算出sgRNA 的体内活性。结果两个sgRNA 的体外活性分别为19. 2%和51. 7%,使用体外活性高的2 号sgRNA 显微注射获得8 只新生小鼠,其中62. 5% ( 5 /8) 的小鼠中检测到Hipp11 位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11 位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR 技术在Hipp11 位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA 体外活性能够预测sgRNA 在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA 的有效手段。