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乳汁中分泌有活性的人凝血因子Ⅸ的转基因羊的研制 总被引:11,自引:0,他引:11
在人类内源性凝血系统中,活化的因子Ⅸ和因子Ⅷ、磷脂、钙离子相互作用,形成一种复合物,使凝血因子Ⅹ转变成活化的因子Ⅹ,促进凝血酶生成,从而在凝血过程中起重要作用.人凝血因子Ⅸ(humanfactorⅨ,hFⅨ)缺乏导致一种X_伴性遗传的出血性疾病血友病B,发病率为1/100000[1].血友病B的治疗目前主要靠替代疗法,即注射正常人血浆制剂以补充患者所缺乏的FⅨ.然而,这种疗法存在着血液来源困难以及从供血者传染肝炎病毒、爱滋病病毒等致病因子的危险,故生产“无毒”的hFⅨ制剂长期以来是人们的迫切愿望.虽然通过重组DNA技术已… 相似文献
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乳腺表达人凝血因子Ⅸ的转基因小鼠的研究 总被引:5,自引:2,他引:3
通过正压手动显微操作技术,将能在离体细胞和活体细胞表达的人凝血因子Ⅸ的表达载体pMCⅨmDNA导入586枚昆明白种小鼠受精卵,随后将显微注射后存活的499枚受精精卵移植于假孕受体母鼠,获得216只F0代仔鼠。PCR和Southern印迹杂产分析证实有6只仔鼠的基因组中有外源基因阳性整合,整合率为3%;ELISA测定2只F0代转基因雌鼠的乳汁中人凝血因子Ⅸ蛋白的含是均已达100ng/ml一期法测定其 相似文献
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由于大多数的β地中海贫血(β~T)突变都是点突变,我们可以人工合成对β地中海贫血基因特异的寡核苷酸来直接检测突变基因。本工作通过合成六种与β地中海贫血突变基因同源的及六种与相应的正常基因同源的寡核苷酸,并用这些寡核苷酸作为DNA 相似文献
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山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L. 相似文献
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山羊 β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达 总被引:3,自引:0,他引:3
构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1,2及内含子1在内的乳腺表达载体,并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因,鼠尾静脉注射实验表明,该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达,应用显微注射方法交该融合基因导入小鼠受精卵,并将受精卵移植于假孕母鼠,共获得33只F0代小鼠,经PCR和Southern印迹杂交证实,有8只小鼠基因组中整合有hAL 相似文献
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反转录病毒介导的人凝血因子IX小基因在奶山羊乳腺中的分泌表达 总被引:1,自引:0,他引:1
通过受精卵显微注射胚胎移植建立哺乳动物乳腺生产系统是近年来生物工程领域的研究热点,但该工作周期长、成本高、难度和工作量都很大.1994年Johanna等人曾经报道以反转录病毒作载体将hGH(human growth hormone)cDNA导入山羊乳腺组织并获得表达.但是由于病毒LTR控制下的hGH基因的表达在活体动物乳腺组织内受到一定程度的抑制,因此表达水平比较低,持续时间短.我们以微小MCK(Muscle creatine kinase)增强子,β-actin启动子控制hFⅨ(human clotting factorⅨ)小基因(minigene)表达顺序反向插入GINa框架,构建为复制缺陷反转录病毒载体.首次通过反转录病毒直接转染活体奶山羊乳腺小叶和乳腺导管导入的方法建立了hFⅨ蛋白的乳腺表达系统.hFⅨ蛋白在羊奶中的最高表达量为47.9ng/mL乳汁,其中1头奶山羊2个月后表达量仍维持在12ng/mL乳汁.Western blot和活性检 相似文献
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反义核酸对β-地中海贫血基因(IVS-2-654 C→T)剪接缺陷抑制作用的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
β-珠蛋白基因第2个内含子(IVS-2)中第654位核苷酸(nt654)C→T剪接缺陷型突变是中国人最常见的β-地中海贫血(简称β-地贫)突变类型之一.我们先前的研究表明,该突变在IVS-2第654位(nt654)上出现的单碱基取代产生了一个新的 GT二核苷酸,它联同旁侧序列构成了一个5'异常剪接位点,同时还激活了IVS-2第579位(nt579)处3'隐匿剪接位点,从而将 IVS-2nt580至 nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的外显子插入外显子2和外显子3之间,产生了异常的β-珠蛋白mRNA,导致β~ -地贫.为了探讨反义核酸治疗β-地贫IVS-2-654 C→T突变的可能性,我们应用体外转录和体外剪接系统,以体外转录产生的特异反义RNA封闭IVS-2-654 C→T突变基因中3'隐匿剪接位点和5'异常剪接位点,使之失去活性,从而减少异常加工的mRNA并且部分恢复了正常剪接途径. 相似文献
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红系特异表达载体在转基因小鼠中表达的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
为在个体水平上研究珠蛋白基因位点控制区的HS2,HS3及HS2-HS3元件对β-珠蛋白基因的时空表达调控作用,选择本实验室构建的CMV/GFP,HS2ALL,HS3ALL,HS23ALL等4种重组载体,经限制性酶切及两步纯化,得到了5种重组DNA片段:CMV/GFP,HS2/GFP,CMV/HS2/GFP,HS23/GFP,HS3/GFP,并用显微注射技术获得转基因小鼠.用流式细胞仪分析转基因各组织中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,结果表明HS2元件及1.7kb的β-珠蛋白启动子足以调控β-珠蛋白基因的组织特异性表达.此外,在不同的转基因小鼠中,GFP的表达虽有明显的个体差异,但综合分析比较可以看出,HS2与HS3元件在调控β-珠蛋白基因表达方面,其增强子作用基本相当,且两者显示出显著的协同作用. 相似文献