具有溶菌酶的部分生物活性的α—乳清蛋白（^32His→Leu,^33Thr→Glu,^103Tyr→Ala）突变体

在溶菌酶催化机理以及α－乳清蛋白和溶菌酶同源比较的基础上,构建了含3个突变点的α－乳清蛋白突变体（H32L,T33E,Y103A）,并将其克隆到具有T7启动子的表达质粒pET28a（＋）中,在大肠杆菌BL21（DE3）／pLys中获得高效表达,存在于包涵体中的目标蛋白经变复性并通过DEAE Sepharose Streamline和Sephacryl S200层析柱获得纯化蛋白,合成底物p-Nitrophenyl-β-D-N′,N″,N′″－Triacetyl-chitotriose [pNP-(NAcGlc)3]与突变体蛋白的反应时间曲线证明突变体蛋白了部分溶菌酶生物活性,为重组难蛋清溶菌酶（HEWL）的5．26％,利用等温滴定量热法测定突变体蛋白与五糖底物chitopentaose的平均热结合能为71．34kJ/mol,重组HEWL为105．47kJ/mol,实验表明,通过有限元的几个突变就可以使α－乳清蛋白获得溶菌酶的活性,这在分子水平上有力地佐证了两者的高度同源性和进化关系。     

两种尿激酶原变体(Ala175→Ser,Tyr187→His,Lys300→His和Ala175→Ser,Tyr187→His)的构建及性质研究

利用定点突变方法 ,构建了尿激酶原变体基因muk1(Ala175→Ser,Tyr187→His ,Lys30 0→His)及muk2 (Ala175→Ser ,Tyr187→His) .两种尿激酶原变体在大肠杆菌BL2 1中表达得到包涵体 ,经体外变复性 ,SP Sepharose离子交换柱层析 ,Benzamidine Sepharose吸附除去双链尿激酶 ,得到的蛋白均为银染一条带 .用人工合成的发色底物S2 4 4 4测量muk1、muk2的动力学性质 ,muk1的内在酶活性比野生型 pro UK降低 8倍 ,muk2的内在酶活性比野生型 pro UK降低 2 .5倍 ;它们经纤溶酶 (plasmin)激活后的双链活性与 pro UK相比分别为muk1提高 50 % ,muk2和pro UK相当 .在实验基础上讨论了 pro UK高内源性催化活性的机制及其结构基础 .     

纤维蛋白高选择性尿激酶变体的研究

双链尿激酶(tcu-PA)作为最早进入临床使用的溶栓药物,由于它对纤维蛋白(fibrin)没有选择性,大剂量静脉注射时会使血液中纤维蛋白原(Fibrinogen)降解,从而引发出血,因此在临床应用上受到限制.单链尿激酶(scu-PA,又称尿激酶原)是tuc-PA的前体,但它不同于一般的酶原,具有一定的内在纤溶酶原激活剂(PA)活性,而且能选择性地在Fibrin表面活化纤溶酶原,从而选择性地溶解血栓凝块.scu-PA经纤溶酶(Plasmin)的作用在Lys158-Ile159肽键断裂,转变成tcu-PA,由Cys148和Cys279间形成的一对二硫键将两条钛链连接、我们以前的工作证明尿激酶A链的Lys151和Arg154氨基酸残基是导致双链尿激酶对纤维蛋白低选择性的结构基础.本文通过定点突变手段构建了变体尿激酶原(Glu151-Gly154-rscu-PA)基因(以下简称mscu-PA),并在E.coli中获得表达、测定了表达产物的双链形式mtcu-PA及未突变的重组尿激酶原(rscu-PA)及其双链形式(rtcu-PA)对Fibrin的亲和性以及对血浆中纤维蛋白的选择性,结果证明所得变体双链尿激酶对Fibrin具有较高的选择性.