荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复

利用GPS-LS接点扫描系统, 在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp (即编码5个氨基酸短肽)的外源片段, 建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库. 利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选, 测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点, 其中位点F295/T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点. 从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二, N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE 内含子元件的原核表达双质粒上, 获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC. 将质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中, 携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长, 而携带单一质粒的不能生长, 表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建, 在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性, 酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48 U/mg.     

转座元件介导的苯胺代谢基因簇的筛选和鉴定

利用苯胺不完全降解时中间代谢产物, 如邻苯二酚等的显色反应, 建立了简便快速的苯胺代谢途径相关基因的功能筛选方法. 从苯胺降解菌株AD9的基因组文库中筛选得到3个阳性重组子pDA1, pDB2和pDB11. AD和C23O酶活测定结果表明, pDA1和pDB11分别含有功能完整的苯胺双加氧酶或邻苯二酚双加氧酶编码基因. 经核苷酸序列分析和拼接获得一个大小为24.7 kb, 含25个可读框的苯胺代谢基因簇, 其中含有17个基因与苯胺代谢有关, 包括调控基因tadR, 苯胺双加氧酶基因簇tadQTA1A2B, 邻苯二酚间位裂解途径酶系基因簇tadD1C1D2C2EFGIJKL. 苯胺代谢基因簇两侧含有转座酶和IS1071序列.     

利用酵母双杂交系统研究斯氏假单胞菌固氮调节蛋白NifL和NifA的相互作用

固氮斯氏假单胞菌A1501(Pseudomonasstutzeri,原称粪产碱菌A1501)于1980年分离自中国南方水稻田,能紧密结合于宿主植物的根表或侵入根内进行生长繁殖和固氮作用,但化合态氮和氧的存在限制了联合固氮效率.本实验室已从该菌中克隆了DNA片段大小为30kb,包含完整nifLA-like基因的ni