斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501氧胁迫下基因表达谱研究

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501分离自我国南方水稻田, 在低铵和微好氧条件下能紧密结合在水稻根表, 并侵入根内生长和固氮. 为探讨氧对A1501基因组表达的影响, 利用全基因组芯片技术, 研究不同氧浓度(0.5%, 21%)下A1501基因组表达谱, 结果表明: (ⅰ) 67个基因在高氧浓度下表达上调2倍以上, 其中17个基因的功能未知; (ⅱ) 68个基因在高氧条件下表达, 其中约50%的基因参与固氮或反硝化. 实时定量RT-PCR验证结果表明, 4个编码氧化还原酶的基因和7个编码胞外夹膜多糖和抗原寡糖合成的基因在高氧下表达上调, 其中sodC在高氧下表达上调2.7倍、编码黄素单胺氧化酶相关蛋白的基因PST1610表达上调2.2倍、编码α-酮戊二酸-铁氧化酶族氧化还原酶的基因PST3584表达上调3.2倍、编码NAD依赖型氧化还原酶的基因PST2179表达上调2.9倍. 这些基因及其表达产物可能在A1501氧保护机制中发挥作用.     

固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转移酶DctPQM的跨膜结构分析与功能研究

固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501四碳二羧酸转移酶系由dctPQM基因编码. 基因序列和结构分析表明, dctP, dctQ和dctM紧密连锁, 并在核苷酸和氨基酸水平上与自生固氮菌棕色固氮菌的四碳二羧酸结合蛋白基因dctP和转运蛋白基因dctQM高度同源. 经分析表明, DctP不含跨膜区, DctQ包含5个跨膜区, DctM包含12个跨膜区. 为验证四碳二羧酸转运系统对固氮能力的增强作用, 将含有完整dctPQM基因的DNA片段连接在自杀性转移质粒载体pSZ21的Tn5转座区域中, 获得重组质粒pSZY6. 采用三亲接合方法, 经Tn5转座作用将dctPQM基因随机插入到野生型菌株A1501的染色体上, 构建了重组菌株A-142. 经nptⅡ基因的PCR扩增实验证明, 该重组菌株确实携带了额外拷贝的dct结构基因. 该重组菌株以不同浓度的琥珀酸、延胡索酸和苹果酸(20, 10和5 mmol/ L)为惟一碳源生长时, 其固氮活性均明显高于野生型菌株A1501, 表明额外拷贝的四碳二羧酸转移酶系编码基因dctPQM能增强受体菌的固氮能力.     

水稻根际固氮细菌的研究

水稻根际的固氮细菌活动颇为活跃,它的种类也很多,是一个潜在的氮肥来源,国内外都在进行广泛深入的探讨。我们从广东的水稻根际发现了一种新的有较强固氮能力的细菌,代号A-15。为革兰氏阴性杆菌,无脂肪粒,周生鞭毛。其性状特征符合于迄今未发现有固氮能力的产碱菌属。初步鉴定为粪产碱菌(Alcaligenes faccalis)。它是微好氧固氮菌,利用有机     

固氮条件下Greifswald磁螺菌的深层培养及其固氮活性的调节

建立了Greifswald磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense)在固氮条件下(微好氧和限铵)的深层培养技术．在以乳酸钠为碳源的限氮培养基中，通入含0．4％—0．8％ O2的氮气，pH和温度分别控制在7．2和30℃，经3次补料，培养21h细胞密度A600nm可达1．3，固氮活性为217nmol/h。氧和铵对固氮活性有明显的抑制作用，说明该菌具有固氮酶合成后的活性调节系统。     

巴西固氮螺菌鞭毛调节基因 flbD鉴定

克隆并测序了巴西固氮螺菌包括flbD基因在内的鞭毛基因簇片段。flbD突变株失去运动能力，不能合成极生鞭毛和侧生鞭毛（Fla^-Laf^-)。转入质粒携带的多拷贝flbD基因使该菌株恢复鞭毛和运动能力，但合成侧生鞭毛数目减少，在半固体平板上爬行圈比野生型的大。说明在巴西固氮螺菌中，FlbD对极生鞭毛和侧生鞭毛的合成调控起重要作用。     

基因nifA经转座子Tn5整入阴沟肠杆菌E26及催娩克氏杆菌NG13基因组的试验

根际固氮细菌与禾谷类作物水稻、小麦、玉米等的联合固氮的研究表明,由于根际固氮细菌的活动而使植物有不同程度的增产。 先前已有报道丘元盛等及Yoo等分别分离到能与水稻联合固氮的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)E26和催娩克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)NG13,这二株水稻根际固氮     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) nifA基因通过诱导宿主防卫反应调节根瘤的形成

苜蓿中华根瘤菌nifA基因是固氮基因的正调节因子, 本文研究了nifA基因对根瘤形成的调节作用. 在分裂根实验中, nifA突变株对另一侧根的结瘤抑制率比野生型菌下降43.7%, 感染突变株植物合成的植保素和形成的坏死细胞的数量也相应减少, 与植物防卫反应相关的苯丙氨酸解氨酶基因、查儿酮合成酶基因和几丁质酶基因不能表达. 这些结果说明, 苜蓿中华根瘤菌nifA基因通过诱导宿主植物的防卫反应对根瘤的形成进行调节. 虽然nifA突变株在宿主植物上引发根瘤的数量增加, 它合成的结瘤因子的量却比野生型菌株少. 因此, 可以推测nifA基因介导了多种信号途径对根瘤的形成进行调节.     

固氮细菌找到新寄主

研究人员促成了固氮根瘤菌到包括稻子在内的非豆科植物的根际安家结瘤.固氮根瘤菌是一种极其特别的细菌.除个别例外,它们只能在豆科植物例如大豆,苜蓿和刺槐的根部结瘤固氮.这种细菌,摄取在空气中无用的氮气,并将其转化成氨和植物的其他营养成份.实际上,细菌是为     

Frankia纯培养的无细胞抽提液固氮

自从1960年Carnahan等人证明巴氏梭菌粗抽提液的固氮酶活性以来,迄今已从大约20种不同微生物中获得了含固氮酶活性无细胞制剂,并对其中一些固氮酶的性质作了详细研究。但对非豆科树木形成固氮根瘤的Frankia内生菌纯培养尚未见报道。     

巴西固氮螺菌GlnB与NifA蛋白N端结构域的相互作用

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)可与多种重要作物联合固氮, 具有作为生物肥料的潜能. 固氮基因(nif)的转录激活蛋白NifA和PⅡ信号转导蛋白家族成员GlnB是参与该菌固氮调控的两个关键蛋白, 且NifA的活性调控依赖于GlnB. 研究结果表明, 在无氮条件下GlnB与NifA蛋白N端结构域存在相互作用, 且N端18和53位酪氨酸突变为苯丙氨酸的NifA与GlnB的互作增强. 研究还发现, NifA蛋白N端66~88位和165~176位氨基酸区域对于与GlnB蛋白的相互作用是必需的.     

弗兰克氏菌固氮基因片段的分离及其比较

弗兰克氏菌和放线菌结瘤植物(actinorhizal plants)之间的共生与根瘤菌和豆科植物间的共生有很多相同点:如侵染过程、瘤结构形态和固氮效率等;但同时它又比根瘤菌有更广的寄主植物范围(涉及8科至少23属200多个种),远远超出了根瘤菌寄主范围的限制,因此被认为是研究有关共生基因特别是与寄主专一性有关的基因的很好的材料。自1978年第一株     

结瘤基因群调控蛋白Nod D在DNA分子上的结合位点的测定

豆科植物和根瘤菌协同进行共生固氮,是自然界将游离的N_2转化成有机NH_3的主要途径之一。共生固氮只有在根瘤内环境中才能进行。通过转座突变、重组克隆和转化等一系列实验后发现,共生固氮菌中存在着一群特定的基因——结瘤nod基因,它们引起植物根部结瘤,并决定寄主的专一性。不同根瘤菌内的nod基因数量虽然不同,但一般不超过十多个。     

禾本科/豆科间作促进豆科共生固氮机理研究进展

综述以往研究发现,大多数禾本科/豆科间作都会显著增加豆科作物的固氮比例(%Ndfa),并认为这种增加是由于禾本科作物对豆科作物根际氮素的耗竭作用引发的.但豆科作物体内通常会在氮磷之间保持稳定的化学计量关系,豆科作物共生固氮的增加会使作物生长受到磷的限制.在这种磷素限制条件下豆科作物会被激发出潜在的磷吸收策略,即通过根系分泌物或丛枝菌根真菌增加对土壤磷素的获取满足其自身固氮对磷素的大量需求,进而增强豆科作物自身的结瘤及固氮.此外,随着分子生物学技术的发展,新近研究发现禾本科作物根系分泌物能上调豆科根部关键结瘤基因NODL4, ENODL2, ENOD93,固氮基因FixI3,查尔酮-黄酮异构酶CFI基因和生长素响应基因GH3.1的表达,这些基因超量表达可促进豆科作物类黄酮物质的分泌、根毛卷曲、结瘤并促进豆科作物固氮.间作作物间通过根际氮素耗竭作用、磷素活化作用以及固氮基因分子调控等三个层面上互相偶联来促进间作系统氮素吸收、优化氮素利用效率和提升作物产量,这些研究对促进和发展禾本科/豆科间作固氮理论体系具有重要指导意义.     

生物固氮机制研究的进展

早在1885年,Berthelot通过盆钵试验,就证明了微生物固定空气中氮素使土壤肥沃的事实。十年后,Winogradsky(1894)第一次从土壤中分离出巴氏梭菌的纯培养。以后Beijerink(1901)分离出固氮菌的纯种。到目前已发现很多其他固氮微生物,包括产气杆菌、多粘芽孢杆菌、无色杆菌、极毛杆菌、甲烷杆菌、红螺菌、红硫细菌、绿硫细菌、红色小杆菌、红酵母、蓝藻,以及与豆科植物共生固氮的根瘤菌和与非豆科植物共生固氮的放线菌(?)。此外也声称菌     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii))HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)固氮调节基因nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux的结瘤固氮效率有促进作用.首先构建一个带有Kp nifA的重组质粒pXD1,使nifA在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达.当质粒pXD1转移至大豆根瘤菌RfHN01lux后,获得带Kp nifA的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显提高,感染大豆幼苗后,大豆生物量的增加,如植株株高、植株鲜重、植株干重及大豆产量均优于原始出发菌.     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

紫云英根瘤菌nif DNA的分子克隆

固氮微生物中涉及到与固氮作用有关的基因的研究已有详细的报道. 共生固氮根瘤菌中参与固氮作用的基因有二类,一类是与肺炎克氏杆菌Kp nif基因有同源性的基因——nif基因,另一类是在共生状态进行固氮作用所必需的其它基因——fix基因.根瘤菌中nif与fix基因中的任何一个基因发生突变,根瘤菌虽仍感染宿主发育成根瘤,但不能固氮.     

碳代谢总体调控蛋白CRP对肺炎克氏杆菌nif 启动子的抑制作用

在肠道细菌中，碳代谢总体调控蛋白CRP（也称为cAMP受体蛋白）通过PTS系统介导葡萄糖效应，调控σ70依赖型碳源分解代谢操纵子的转录活性，当自生（联合）固氮的肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae)以不同的碳水化合物作为惟一碳源生长时，其固氮活性明显不同，且这种不同碳源对固氮活性的影响发生在基因表达调控水平上，在近缘的大肠植杆菌遗传背景下的进一步研究表明，在cAMP存在时，CRP对肺炎克氏杆菌所有的σ54依赖型nif启动子（nifB,nifE,nifF,nifH,NifJ,nifLA,nifU)都有抑制作用，序列分析结果表明，CRP的抑制作用与其在这些启动子上游的DNA顺式作用元件无直接相关性，对肺炎克氏杆菌crp基因的分离，测序结果显示，其编码的CRP蛋白与已知的大肠杆菌CRP蛋白在序列与功能上高度保守，因此认为不同碳源代谢对固氮基因的调控作用可能是由CRP－cAMP复合体介导的，这一研究工作将碳代谢调控系统和固氮调控系统通过CRP－cAMP耦联在一起，具有重要的生理学意义。σ     

生物工程在树木固氮方面又结出硕果

1991年5月份,法国第七巴黎大学的科学家们菲利莆(Phelep)等利用生物工程技术,由含有两种根状农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)品系A_4或2659的木麻黄科植物Allocasuarina verticiliata培养的上胚轴,子叶扣下胚轴诱导毛状根从而获得了具固氮能力的,可以在无激素培养基上生长的并发育出异常广阔的根系统的转基因植物。通过特异的章鱼碱的存在和Southern斑点印迹分析均肯定了上述的实验结果。由此,法国的科学家们在树木固氮的生物工程研究方面取得了突破性进展,为人类能够最终利用大气     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）固氮调节基因ｎｉｆＡ对大豆根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）ＨＮ０１ｌｕｘ的结瘤固氮效率有促进作用。首先构建一个带有Ｋｐ ｎｉｆＡＨ的重组质粒ｐＸＤ１,使ｎｉｆＡ在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达。当质粒ｐＸＤ１转移至大豆根瘤菌ＲｆＨＮ０１ｌｕｘ后,获得带Ｋｐ ｎｉｆＡ的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显