人乳铁蛋白(hLF)cDNA的克隆及序列分析

从正常人外周血中分离中性粒白细胞（WBC）,提取总RNA,用RT—PCR的方法扩增人乳铁蛋白（hLF）cDNA．cDNA分hLF1．5、hLF0．8两段扩增并连入pMD18-T载体上,再利用限制酶连入巴氏毕赤酵母表达载体pPICZα—A中,构成完整的hLF基因．序列测定表明,所克隆的hLF基因序列全长为2,136bp,与Gene Bank中登录的序列相比,同源性达99％以上．     

暴马桑黄MVD基因cDNA全长克隆及表达特性分析

对暴马桑黄中参与三萜合成途径的关键酶——甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MVD）基因进行克隆及表达特性分析，以了解暴马桑黄三萜合成的调控机制。     

薄壳山核桃CiDGAT1基因的克隆及表达模式分析

研究薄壳山核桃（Carya illinoinensis）CiDGAT1基因的结构特征和表达模式，为深入分析CiDGAT1基因功能提供理论参考。     

黑麦Rubisco大亚基基因(rbc L)的克隆及其限制性内切酶图谱的构建

以小麦的rbc L为探针,分别与黑麦ctDNA EcoR I,BamH I,Hind III的酶切谱带进行Southern杂交。结果发现,E13(2.15 kb),B2(10.7 kb),H2(10.4 kb)均含有rbc L基因。用pUC9为载体克隆黑麦ctDNA的B2片段,Southern杂交后表明,得到的重组质粒含有rbc L基因,将其命名为pRCB2。设计了一种快速准确的分析方法,构建出pRCB2质粒DNA的限制性内切酶图谱,rbc L被定位在一个2.8 kb的区域内。     

大鼠神经突起因子的克隆及表达载体的构建

从成年SD大鼠脑组织分离提取总RNA，反转录PCR扩增出鼠神经突起因子(neuritin)cDNA的最大开放阅读框(opening reading frame，ORF)后，重组于克隆载体pGEM3z上，经PCR、限制内切酶鉴定和DNA测序鉴定，扩增出的cDNA426bp全部核苷酸序列与国外文献报道的完全一致；在已构建好的重组克隆载体neuritin-pGEM3z基础上，将该neuritin ORF亚克隆到原核表达载体pQE30上，为获取具有天然活性的neuritin蛋白及其功能研究提供了基础。     

天花粉蛋白基因克隆、序列分析及在E.Coli中表达

天花粉蛋白为单链核糖体失活蛋白,具糖苷酶活性,对 HIV 和多种动植物病毒有明显的抑制作用,有广泛的理论价值和应用前景.本文在国内首次采用聚合酶链式反应(PCR)方法,以栝楼染色体 DNA 为模板、合成的寡聚核苷酸为引物,扩增出了编码成熟天花粉蛋白的 DNA 片段(称 gene 1)和编码含23个氨基酸组成的分泌型信号肽、成熟天花粉蛋白以及羧基端延伸因子在内的 DNA 片段(称 gene 2).两 DNA 片段已被组装于载体     

酵母酸性磷酸酯酶基因PHO81克隆的初步研究

酵母PHO81基因是调控阻遏酸性磷酸酯酶的的一种中介因子,其编码区由3531个核苷酸组成。由于片段较大,目前很难应用PCR技术一次予以扩增。本文用自行设计的4个引物以啤酒酵母总染色体DNA为模板借助PCR技术扩增PHO81基因的两个片段,其长度分别为1.3kb和2.2kb,通过限制性酶切将其装入载体质粒pUC18中。并初步进行了重组质粒限制性内切酶酶谱分析和Southern杂交试验。     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA的克隆和序列分析及其在大肠杆菌中的表达(英文)

以poly(A)~ mRNA为模板,噬菌体λgt 10 DNA为载体构建了黑曲霉3758的cDNA的文库。用编码黑曲霉葡萄糖淀粉酶329—418位氨基酸的DNA顺序(456bp)作探针从该文库中筛选葡萄糖淀粉酶cDNA。采用原位噬菌斑杂交法获得11个阳性噬菌斑,从其中6个噬菌体中提取DNA进行限制酶切分析和印迹法转移杂交试验,发现这些阳性噬菌体DNA含有不同大小的插入片段,它们都能与DNA探针杂交,表明已克隆了葡萄糖淀粉酶的cDNA。采用单酶切及交叉双酶切法制定了2.1kbcDNA的物理图并对2.1kb片段作了全序列分析。序列分析结果显示,克隆的2.1kb片段含5＇端非编码区,编码葡萄糖淀粉酶的结构基因及3＇端非编码区。克隆的cDNA片段转移至表达载体λgt11,感染大肠杆菌后,产生的噬菌斑转移硝酸纤维素滤膜后与~(125)I标记的抗葡萄糖淀粉酶抗体进行免疫反应,结果证明含2.1kbcDNA的λgt11表现葡萄糖淀粉酶阳性.2.1kb片段也曾转至质粒pPL2,转化大肠杆菌JF1125。细胞裂解物在SDS-PAGE电泳中可看到新的蛋白带。这些结果表明,克隆的黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA可以在大肠杆菌中表达。     

脂肪酶产生菌的筛选及基因的克隆表达

目的筛选出脂肪酶活性较高菌株,通过脂肪酶基因克隆技术获得高表达的脂肪酶,根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.方法采用透明圈法,以三丁酸甘油酯为底物筛选脂肪酶活性较高菌株;通过PCR扩增获得其脂肪酶基因Pseudomonas peli(PP)序列,构建pET-28 a表达载体,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达;通过Ni柱将脂肪酶纯化,并根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.结果筛选到一株脂肪酶活性较高的菌株,16S rRNA基因序列比对结果初步鉴定为Pseudomonas peli.PCR扩增得到的基因片段长度为801 bp,其序列与Pseudomonas peli中的脂肪酶基因序列相似性达到100%,PP基因在大肠杆菌中异源表达蛋白的分子量约29 KD,该蛋白在55℃、pH 7.0时活性最高.结论通过基因克隆表达后得到的脂肪酶Ni柱纯化后纯度达95%以上,且耐高温,为脂肪酶工业化应用奠定了基础.