六种核酸提取试剂盒对粪样中小鼠肝炎病毒核酸 提取效率的比较

目的 比较六种商品化试剂盒在小鼠粪便中提取小鼠肝炎病毒(MHV)RNA的效率,筛选出效率高、耗时短的核酸提取方法。方法 采集感染MHV小鼠的新鲜粪便样本,分别用液氮研磨法、磁珠匀浆法以及PBS溶解离心法进行处理,通过同一核酸提取试剂盒比较病毒核酸提取效率,明确最佳样本前处理方法;之后,用6种试剂盒进行RNA提取,经反转录后进行TaqMan实时定量PCR检测,以Ct值评价6种试剂盒的提取效率,结合产物测序和血清抗体ELISA结果,筛选MHV的最佳核酸提取方法。结果 对于粪便样本的前处理,液氮研磨法的RNA提取效率显著高于磁珠匀浆法。对于6种试剂盒的提取效果,TIANGEN DP422[总RNA浓度：(549.70±52.38) ng/μL,Ct值：(24.51±0.10)]核酸提取效率最高;TIANGEN SD101[总RNA浓度：(274.13±6.87) ng/μL,Ct值：(2.39±0.017)]和QIAGEN 52904[总RNA浓度：(288.13±15.11) ng/μL,Ct值：(2.40±0.012)]用时最短;XS VRL[总RNA浓度：(348.80±15.85) ng/μL,Ct值：(24.70±0.13)]操作最为方便。结论 粪便样本前处理建议采用液氮研磨法。针对粪便中MHV RNA的提取,TIANGEN DP422提取效率最高,推荐用于小鼠肝炎病毒的分子生物学检测。     

干扰长链非编码RNA Z38表达对鼻咽癌细胞增殖的影响

新型的长链非编码RNA Z38已证实高表达于肿瘤组织,低表达于癌旁组织,属于癌基因,但其功能和作用机制尚需深入分析。研究目的在于探讨稳定干扰长非编码RNA Z38对鼻咽癌细胞HNE1、5-8F功能和机制的影响。采用慢病毒包埋Z38-shRNA转染进人鼻咽癌细胞HNE1与5-8F,用嘌呤霉素筛选出稳定的干扰细胞系,利用相对实时荧光定量的方法检测干扰效率;使用MTT、和平板克隆集落形成实验验证其对HNE1、5-8F细胞增殖的抑制作用;Transwell检测细胞迁移的能力;采用Western Blot检测干扰Z38表达对抑癌因子P~(53)、P~(21)表达水平的影响。结果表明,慢病毒干扰鼻咽癌细胞显著降低了Z38基因表达水平,并且干扰Z38基因表达后使细胞增殖能力、细胞集落形成能力降低,穿过Transwell小室的细胞数降低,抑癌因子P~(53)、P~(21)表达量上调。由此推测,Z38基因可能为鼻咽癌细胞的癌基因之一。     

特异性iRNA应用时机、种类与伤鼠免疫功能变化关系的实验研究

目的探讨伤后免疫核糖核酸（iRNA）应用时机、种类与伤鼠免疫功能变化的关系。方法：将烫伤大鼠随机分成两批9组,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和3H－TdR掺入法,分别测定各组烫伤大鼠伤后10天时IL-2活性,NK细胞活性和T、B淋巴细胞增殖反应能力的变化。结果：（1）伤后三种iRNA联合用药组NK细胞活性和B细胞增殖反应能力恢复较快,至伤后第10天时分别达到正常的102．0％和95．7％,明显优于单用一种和合用二种组;（2）伤后早期（第1天开始）应用iRNA组IL-2活性和T细胞增殖反应能力恢复较理想,至伤后第10天时分别达到正常的95．8％和98．8％,明显优于伤后2、3、5天开始用药组。结论：伤后尽早联合应用三种iRNA对防止和／或纠正伤鼠免疫功能失常具有重要作用。     

mRNA二级结构对重组人白血病抑制因子(rhLIF)在大肠杆菌中表达的影响

真细菌中翻译起始效率通常是由翻译起始位点两侧的ｍ ＲＮＡ 区域二级结构的稳定性决定的．这种稳定性与该区域ＲＮＡ 二级结构的发生自由能（ΔＧ０ ）相对应．重组人白血病抑制因子（ｒｈＬＩＦ）为具有诱导白血病细胞分化、调节骨组织的生长代谢、维持胚胎干细胞的基本特征、促进神经元的分化等广泛生物学活性的细胞因子．为了获得高表达的ＬＩＦ蛋白,通过翻译起始区的位点专一突变,把具有优选密码子和能量优势的ｌｉｆ 片段克隆入ｐＪＬＡ５０３ 载体,然后转化至大肠杆菌中表达,得到表达量提高１０ 倍的重组ＬＩＦ蛋白     

HCV全长cDNA细胞培养适应性突变体的构建及其体外转录制备感染性RNA的研究

运用重叠延伸PCR方法对HCV全长基因组cDNANS3和NS5A上的E1202G、T1280I和S2197P进行细胞培养适应性突变,构建含有细胞培养适应性突变的HCV全长基因组cDNA,体外转录制备RNA,脂质体法转染人肝癌细胞Huh-7,以RT-PCR检测HCV正、负链RNA,间接免疫荧光法和Western blot检测细胞内HCVNS3蛋白的表达。结果证明,转染后细胞内可间断检测到HCV正、负链RNA及HCVNS3蛋白的表达,且突变体RNA与未突变的HCVRNA相比,明显具有更高的复制效率和蛋白表达。该研究为后续HCV体外培养体系的研究提供了可在细胞内高效自主复制的HCV病毒模板。     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

RNA干扰在肿瘤转移研究中的应用

RNA干扰是与特定基因同源互补的双链RNA在体内以序列特异的方式引发靶基因的mRNA降解,从而导致转录后基因沉默的过程。由于其在基因沉默中的高度特异性和有效性,在基因功能和基因药物的研究中有很大潜力。综述了RNA干扰可能的分子机制、分子生物特性和其在肿瘤特别是肿瘤转移中的应用。