猪β干扰素基因17位丝氨酸突变体重组酵母表达载体的构建

根据猪β干扰素基因序列设计一对引物,并按酵母密码子的偏好性,在引物中对稀有密码子进行同义突变,即第3位的TAT基因突变为TAC,第7位的CGA基因突变为AGA,第164位的CGG基因突变为CGT。同时,利用聚合酶链式反应基因定点突变技术,把17位的半胱氨酸密码子TGT突变为丝氨酸密码子TCT,构建poIFNβSer17...     

离子注入水稻细胞学效应研究

以水稻品种紫粳二倍体和四倍体为实验材料,以低能氮离子束为诱变源,研究了离子束诱变对水稻根尖细胞染色体的影响.结果发现,低能离子束注入引起了水稻根尖分生区细胞有丝分裂异常,出现许多染色体畸变类型,包括后期染色体桥、落后染色体、染色体断片、中期染色体单价体等.染色体畸变率并不是随着剂量的增加呈现直线上升的趋势,而是有一定的...     

复合诱变和原生质体融合选育S-腺苷甲硫氨酸酿酒酵母高产菌株

对生产S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的酿酒酵母（S.cerevisiae）菌株R1进行复合诱变和原生质体融合。采用酶解法获得出发菌株S.cerevisiae R1的单倍体菌株hR10,对其进行UV和DES复合诱变,筛选出了4个单倍体正突变株DR1-3、NM14、NM39和NM45。制备了单倍体正突变株的原生质体,采用热灭活和UV灭活法灭活双亲原生质体,在聚乙二醇（PEG）的诱导下进行原生质体融合,筛选得到融合子F35,其生产 SAM的产量为22.5 mg/L,与出发菌株R1（11.1 mg/L）相比,提高了103%,并且能够稳定遗传。采用正交试验优化了F35发酵生产SAM的培养基和发酵时间,优化了的培养基配方为麦芽糖100 g/L,蛋白胨10 g/L,NH₄H₂PO₄4g/L,NH₄Cl₅g/L,MgSO₄0.1g/L,KH₂PO₄6 g/L,发酵时间为72h。     

拟南芥抗盐突变体的筛选

盐胁迫是影响植物生长发育的非生物胁迫因素之一,目前发现的盐胁迫信号途径的基因还非常有限.发掘新的耐盐相关基因对于了解植物的盐胁迫响应机制和改善作物的耐盐性具有非常重要的意义.从EMS突变体库中筛选突变体是一种经典的正向遗传学方法,有可能筛选到从T-DNA插入突变体库中无法发现的新基因.本实验用160mmol/L NaCl作为盐胁迫的筛选条件,以在含盐平板上长出绿色子叶作为筛选指标筛选抗盐(Salt Resistant,ST)的EMS突变体,初步筛选到了140株ST突变体,其中84株收到了种子,第二代进行抗盐表型确定后,得到了15株表型稳定的ST突变体,均表现出明显的抗盐表型,并对其中的一些突变体做了初步的表型及基因定位分析.     

山药愈伤组织EMS诱变及其再生苗变异研究

为了加速创造山药新种质,以"明淮2号"山药愈伤组织为材料,研究了不同浓度EMS[0(ck),0.05%,0.1%,0.2%,0.3%]、不同时间[0(ck),6h,12h,24h,48h]处理对山药愈伤组织致死率的影响,以确定半致死浓度和时间;比较了在半致死处理后愈伤组织不同继代次数的影响情况;并对再生植株进行形态学比较和分子鉴定.结果表明,EMS诱变浓度和时间都对山药愈伤组织的致死率有显著影响,且EMS诱变浓度影响更显著,适宜的诱变方法为0.1%EMS浓度处理48h.诱变后愈伤组织增殖系数和分化率随继代次数增加而增加,但诱变率随继代次数增加而显著降低,诱变后愈伤组织经过一次继代后转入分化有利诱变体的筛选.再生植株主要发生叶色、叶型变异,通过RAPD标记鉴定结果显示有8份表型突变体植株条带确实出现了差异.     

计算机辅助木糖还原酶定点突变的生物信息学分析

木糖还原酶（xylose reductase,XR）是木糖代谢生成乙醇途径中一个重要的酶,目前利用纤维素生成酒精的关键问题之一：木糖代谢过程中XR和木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase,XDH）的氧化还原不平衡。本研究借助生物信息学手段（酶三维结构建模、酶和辅酶分子对接）,充分分析数据库资源,找到了一些可能影响XR酶活性或辅酶依赖性的关键氨基酸。毕赤氏酵母XR与NADP之间有Lys21（K）、Val222（V）、Glu223（E）、Phe236（F）和Thr273（T）;毕赤氏酵母XR与NAD之间有Val222（V）、Glu223（E）、Phe236（F）、Glu237（E）和Thr273（T）;热带假丝酵母XR与NADP之间有Asn278（N）和Arg282（R）。对比两种辅酶与毕赤氏酵母XR形成氢键的氨基酸,如果使毕赤氏酵母XR只与辅酶NAD结合,则可以将Lys21替换成其它的氨基酸,因Lys21在所有XR序列中完全保守,需要进行氨基酸替代模拟计算预实验,在确保酶三维结构不变及NAD可以结合XR的前提条件下替代Lys21;如果使毕赤氏酵母XR只与辅酶NADP结合,则可以将Glu237（不完全保守）替换成其它的氨基酸。另外,还可以根据需要将这些形成氢键的氨基酸进行组合替代。要改变热带假丝酵母XR的NADP依赖性,可以替代Asn278（N）和/或Arg282（R）（不完全保守）。本研究为进一步酶的理性设计（提高活性及改变辅酶依赖性）并在分子水平上对木糖还原酶进行改造打下了基础。     

The role of β18-β19 loop structure in insecticidal activity of Cry1Ac toxin from Bacillus thuringiensis

The β18-β19 loop in domain Ⅲ of Cry1Ac toxin is unique among Bacillus thuringlensis Cry proteins. In this study, the role of the loop structure in insecticidal activity of Cry1Ac toxin was investigated. Alanine scanning mutations within the loop were initially generated and most mutants were over-expressed and reduced toxicity at different degrees, except mutant N546A that showed almost 2 times enhanced toxicity against Helicoverpa armigera larvae. Further mutagenic analysis of N546 revealed that a charged amino acid in this position would cause very unfavorable influence on insecticidal activity. In addition, the deletion of N546 led to protein instability because of destruction of the loop integrity. Besides, mutant W544F was much more toxic than W544Y, indicating that hydrophobic nature of the position was important for maintaining the stability and activity of Cry1Ac protein. These findings are the first biological evidence for a structural function of β18-β19 loop in insecticidal activity of the Cry1Ac toxin.     

T-DNA transfer and integration as a tool for insertional mutagenesis in the taxol-producing fungus

Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transformation method was applied to transform Nodulisporium sylviforme fusant HDF-68, a taxol-producing fungus. We constructed a binary vector pBI121-43 carrying a hygromycin-resistant gene cassette between the right and left borders of T-DNA. Optimal co-cultivation of N.sylviforme with A.tumefaciens containing pBI121-43 led to 110～130 hygromycin-resistant transformants per million conidia. Putative transformants were found to be mitotically stable. The molecular analysis of transformants demonstrated the random integration of single copy of the T-DNA into the host genome. This transformation system serves as a basic tool for insertional mutagenesis in N.sylviforme fusant HDF-68, and the development of such system lays a solid foundation for constructing high-yied gene engineering strain and clarifying taxol biosynthesis pathway in this fungus.     

大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体:M1(H20L)、M2(K60E)、M3(K94E),并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达.酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1.10、1.22和1.37倍,且比活力都有不同程度提高.与含野生型pyrBI基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15,mmol/L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5.4、6.0和8.5倍.最后将各突变质粒转入到E.coli Cyt10(Δcdd)中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化.