葡萄牙松材线虫与其媒介昆虫之间的互作Pedro Miguel Naves, Luís Bonifácio, Edmundo Sousa

对松材线虫与其在葡萄牙和欧洲的媒介昆虫樟子松墨天牛（Monochamus galloprovincialis）进行了首次研究。在病死木中发现,松材线虫在天牛刚羽化时聚集在蛹室中,线虫主要集中在天牛的后胸部。天牛羽化后6周内,松材线虫主要在天牛成虫补充营养时进入新寄主树,其次在天牛产卵时也会进入寄主树。总的看来,松材线虫在欧洲与其携带天牛之间互作与其在亚洲与松墨天牛及在北美与卡来罗纳墨天牛之间的关系十分相似。经研究,影响线虫与天牛携带关系的因子有内源和外源两类因子,如化学气味和各种信号。但是,其他多数因子尚未了解。研究影响线虫与天牛携带关系的因子将有助于了解两种生物密切关系的内在机制,并有助于研发出新的防控方法。     

专题报道Ⅰ：松材线虫病致病机理与病害防治（执行主编 叶建仁）专题编者按

松材线虫病是在我国发生最严重的毁灭性森林病害,已经在10多个省市区造成了严重的经济和生态损失。该病害原产地为北美洲,自20世纪初先后传入东亚的日本、中国和韩国等,给这些国家的松林带来了巨大的破坏。我国于1982年首次在南京发现松材线虫病,40年来病害一直在不断扩展蔓延。至2021年底,我国有19个省（自治区、直辖市）的728个县级行政区被划分为疫区,当年病死松树达到数千万株,防控形势异常严峻。本专题针对当前松材线虫病流行与防控中的一些热点和难点问题,围绕分子致病机理、疫源追溯和病害防治方法等方面开展研究,通过RNA干扰、基因重组和酵母转化实验明确松材线虫性别分化基因和热激转录因子在生长发育过程中和性别分化中具有的重要作用;以新一代测序技术、分子标记手段研究分析松材线虫在我国的种群分化情况,揭示不同线虫类群与地理区域间呈现的相关性;利用微生物培养、浸渍提取法和生理生化指标测定等方法,筛选并获得一系列对松材线虫具有明显拮抗作用的腐生线虫、松树内生细菌和植物提取物。本专题研究内容有助于深入解析松材线虫病在我国的传播蔓延规律,揭示松材线虫致病关键基因功能,提出病害防控的新方法,从而为更好地防控这一重大外来入侵物种引起的病害提供重要的理论和实践支撑。     

松材线虫性别决定基因Bx-sex-1表达特征和生物学功能分析

【目的】揭示松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)性别决定基因Bx-sex-1的表达特征和生物学功能。【方法】通过Mega 6中的Jones-Taylor-Thornton (JTT)模型,采用邻接法(neighbor joining,NJ)对Bx-sex-1和其他线虫的氨基酸序列进行系统发育构建。采用同步培养的方法分别收集不同龄期的松材线虫并提取总RNA,反转录获得cDNA并采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 的方法,研究Bx-sex-1在松材线虫不同发育阶段的相对表达量。同时采用qRT-PCR并通过绝对定量法分析Bx-sex-1基因在雌虫和雄虫基因组的拷贝数。采用dsRNA浸泡法对目的基因进行干扰,观察松材线虫后代卵的孵化率和雌雄比的变化。【结果】系统进化树显示松材线虫Bx-sex-1和其他两个植物寄生线虫成为一支,与自由生线虫和寄生动物线虫分别进化为不同的分支。松材线虫Bx-sex-1在不同发育阶段相对表达量有差异,在卵期相对表达量最高,而在2龄幼虫时期最低,从2龄幼虫时期到成虫时期相对表达量逐渐升高。qRT-PCR结果显示Bx-sex-1基因在雌虫和雄虫基因组中均为单拷贝。Bx-sex-1被干扰后,卵的孵化率下降,雌雄比降低。【结论】松材线虫Bx-sex-1基因在卵的发育过程和性别决定中可能具有重要作用。     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治松材线虫病研究

【目的】松材线虫病是一种由松材线虫对赤松、马尾松、黑松等易感树种寄生取食继而引起树种死亡的病害,其发病速度快、易传播,传统的物理、化学防治成本高,且化学防治对环境易造成不可逆的污染,目前还没有较好的防治方法。为寻找安全有效的生物防治方法,笔者探究蜡样芽孢杆菌在温室下对马尾松盆栽苗松材线虫病的防治效果。【方法】采用人工皮接法将2 000、4 000和6 000条松材线虫AMA3虫株分别接种到2年生马尾松幼苗上,测定发生松材线虫病症状的临界值;蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株是从南京湿地松上分离出的具有杀线虫作用的松树内生细菌,在接种松材线虫AMA3虫株的前7天、当天和接种后第7天用灌根法灌入蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液,并设置对照试验:将发酵液、菌悬液和发酵滤液稀释10倍后,各取20 mL灌注到2年生马尾松根部,其中发酵液和菌悬液的菌体浓度为4×10⁸ cfu/mL,以无菌水和培养基处理为对照,比较蜡样芽孢杆菌不同发酵产物对松材线虫病的防治效果;以灌根法分别施入20 mL菌体浓度为4×10⁸、4×10⁷、2×10⁷ cfu/mL的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液;将蜡样芽孢杆菌以菌粉水悬液灌根法和菌粉涂抹法两种方式处理2年生马尾松幼苗。从施菌浓度、施菌方法和施菌时间等3个方面对经过低温喷雾干燥制备的蜡样芽孢杆菌菌粉进行防治松材线虫病试验,观察各处理下马尾松的发病情况。【结果】2年生马尾松接种松材线虫AMA3虫株后发病的临界值为4 000条。采用灌根法施入蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的发酵液和无菌发酵滤液后不能对松材线虫病起到预防作用,施蜡样芽孢杆菌菌悬液对松材线虫病有一定的预防效果(33%)。蜡样芽孢杆菌对马尾松松材线虫病的预防效果要大于治疗效果,健康马尾松在接种线虫之前以灌根法施入蜡样芽孢杆菌的预防效果会更好。将蜡样芽孢杆菌菌粉直接涂抹松枝,与菌粉水悬液灌根的方法相比,两者对松材线虫病的防治效果相当。同一菌体浓度下蜡样芽孢杆菌菌粉水悬液和发酵菌悬液对松材线虫病的预防效果相当;施用蜡样芽孢杆菌菌粉水悬液对松材线虫病的防治效果随菌体浓度的增加有所提高,当菌体浓度达到一定值以后,增加浓度也不会提高防治效果。【结论】在蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治2年生马尾松幼苗松材线虫病前,先筛选2年生马尾松接种松材线虫的临界值,能有效避免因接种松材线虫浓度过大而使真实防治效果降低的缺点。蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌悬液和经低温喷雾干燥制得的菌粉对松材线虫病均有一定的预防效果,在马尾松未感染松材线虫的健康状态施用蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株效果更好,通过菌粉涂抹法处理松枝可以对松材线虫病产生预防效果。     

一种对松材线虫具有强感染性的内生真菌,Esteya vermicola

2006年在韩国松林土壤中分离出来一种稀有的丝孢菌(分离物CNU 120806)。该菌具有两种孢子,但是仅月型孢子能黏附于线虫虫体上,并感染线虫。该菌消耗线虫营养并生长出线虫虫体,形成新孢子,然后进行新的感染循环。基于形态和分子生物学特征,该菌被鉴定为Esteya vermicola,它是已经被报道过的首例松材线虫的内寄生菌。由于其高度侵染性,有希望成为防控毁灭性的松萎蔫病害的生防菌。生测表明,E.vermicola CBS 115803在4~5 d内就能感染致死几乎全部松材线虫,这是由于其产生了较多的月型孢子。研究还表明,应用该菌的配方具有防控松萎蔫病的生防商业化前景。     

2006—2009年葡萄牙松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)研究进展

1999年松材线虫在欧洲葡萄牙首次被发现。虽然葡萄牙林业和检疫部门尽力防控了该线虫及其携带昆虫——天牛,但是于2008年还是扩散到距原发现地200 km的葡萄牙中心地带的松林。同时,在西班牙边界临近葡萄牙Cáceres 城的边界处也发现了松材线虫。调查发现,虽然该线虫扩散的原因很多,但是主要的因素显然是人为因素。另外,关于松材线虫及其携带者的生物-生态学、松材线虫的致病性及利用分子生物学的诊断和监测等方面取得了较大进展。最近发现了松材线虫携带的导致松萎蔫的细菌。目前急需监测怀疑被浸染的树木及线虫动态的快速方法。线虫基因组学可以提供对松萎蔫病在树体内的病理过程。     

韩国松褐天牛和云杉花墨天牛传播的伞滑刃属线虫

以往研究认为,2006年前在韩国唯一的传播松材线虫的天牛是松褐天牛,但是最近的研究发现云杉花墨天牛也能传播松材线虫。对于两种天牛携带和传播线虫种类,特别是对拟松材线虫的携带和传播途径需要进一步研究。拟松材线虫分为欧洲型和东亚型,在韩国两种生物型都存在。笔者的研究表明大部分云杉花墨天牛携带的是欧洲型的拟松材线虫。     

松材线虫毒力及发育转型与细胞自噬关系研究

采用透射电镜法对松材线虫的细胞自噬现象进行鉴认,并通过实时定量PCR的方法对不同毒力及不同发育期松材线虫的自噬基因BxAtg1和BxAtg8表达量进行测定。结果表明:饥饿诱导下不同毒力松材线虫存在细胞自噬现象,不同毒力松材线虫饥饿诱导12、24、36 h时,自噬基因BxAtg1表达量递减且趋势一致,而自噬基因BxAtg8在饥饿24 h时的强毒松材线虫体内表达量最高,在饥饿36 h时弱毒松材线虫体内表达量显著升高; 与繁殖性松材线虫体相比,自噬基因BxAtg1和BxAtg8在扩散型3龄(J_Ⅲ)和扩散型4龄幼虫(J_Ⅳ)中的表达量均增加,推测自噬活性的调节机制可能与松材线虫的毒力相关,与松材线虫发育转型阶段的形态特征联系,暗示自噬可帮助松材线虫发育转型,从而提高松材线虫的适应性。     

松材线虫与拟松材线虫种间杂交特性研究

选取来自中国、日本和美国的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)4个虫株,以及中国的拟松材线虫(B.mucronatus)2个虫株进行生物学杂交和交配对象选择试验。结果表明:松材线虫和拟松材线虫的部分虫株可以发生种间杂交,正交总交配成功率为4.2%,反交总交配成功率为10%,反交成功率是正交的2倍。杂交整体发生率极低,杂交后代较难形成可持续的繁殖种群。采用松材线虫(简称Bx)/拟松材线虫(简称Bm)快速分子检测系统对杂交F1代幼虫进行分子鉴定,结果表明F1代幼虫既含有Bx分子标记也含有Bm分子标记。继代培养30 d后,杂交后代在基因型上表现出了不同趋向的分化,其中BxAN5♀×Bm JNL1 ♂、BxAN5 ♂×BmAN5♀和BxUSA ♂×Bm JNL1♀的杂交后代趋向于成为松材线虫占主导的种群,BxJNL5 ♂×BmJNL1♀的杂交后代趋向于成为拟松材线虫占主导的种群。在有种内交配资源存在情况下,无论松材线虫还是拟松材线虫均倾向于优先选择种内交配资源。研究表明松材线虫和拟松材线虫之间存在一定的生殖隔离,自然状态下种间交配可能会产生,但杂交后代较难形成可持续性繁殖的生殖后代。     

杀螟松在中山陵林区残留动态的研究

在飞喷后的林分内定期进行采样检测,以研究杀螟松在中山陵林区的残留动态。结果表明,喷洒后7～15天,除个别样品外,其残留都降低到0.5ppm以下,低于欧洲经济共同体法定容许量0.5ppm;喷洒后7天内,对林区内植物无损伤,鸟类没有出现任何异常现象。