三索线蛇与过树容蛇肝线粒体DNA的纯化与限制酶图谱

用Sepharose 4B凝胶柱过滤和NaCl离心法纯化了三索线蛇及过树容蛇肝线粒体DNA(mtDNA),它们的分子长度分别为17.75kb及19.70kb。分别用EcoRⅠ,XbaⅠ,BamHⅠ及BglⅡ等4种限制酶消化这两种mtDNA,结果表明:EcoRⅠ,XbaⅠ,BamHⅠ和BglⅡ在三索线蛇肝mtDNA上分别有1,1,2及3个切点;在过树容蛇肝mtDNA上各有4,1,1和2个切点。根据mtDNA的单酶、双酶和部份酶解片段的分析,建立了三索线蛇及过树容蛇肝mtDNA的限制酶图谱。     

黑曲霉基因文库的构建及葡萄糖淀粉酶基因的克隆

用噬菌体λEMBL3 DNA为载体成功地构建了黑曲霉3758的完整的基因文库。供体黑曲霉染色体DNA经EcoRI部份酶切和蔗糖密度梯度离心,回收15—20kb片段,以一定的比例与经EcoRI处理的载体λEMBL3 DNA连接,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统提取的包装蛋白进行体外包装,包装物感染宿主大肠杆菌Q359,获得2.5×10~5重组噬菌体/μgDNA的包装效率,比Clarke-Carbon公式对构建黑曲霉染色体基因文库要求的重组克隆数高10倍。以编码葡萄糖淀粉酶第329—481位氨基酸的DNA作为探针,用原位噬菌斑杂交的方法,从10~5个重组噬菌斑中筛选出2个杂交阳性噬菌斑。复筛以后,用快速法提取DNA,经EcoRI和EcoR V双酶切以后,走电泳,用Southern印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,与~(32)p-标记的探针杂交,证实葡萄淀粉酶基因位于2.5kb的EcoRI、EcoR V片段上,该片段已亚克隆至ρBR322。     

人纤溶酶原K1—3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原Krigle 1-3(K1-3)基因插入融合表达载体pET-17b，获得重组质粒pET-K13,转化E.coli BI21(DE3),在IPTG诱导下，人纤溶酶原K1－3基因在E.coli BI21(DE3,pET-K13)中获得高效融合表达，表达量占菌体总蛋白的24％，表达产物以包函体存在，Western blot证明重组 蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性。     

波氏假丝酵母启动子的克隆及新霉素基因的表达

报道了波氏假丝酵母（Candida boidinii)启动子的克隆,将克隆的启动子与Neo^ 基因重组构建了含Neo^r基因的表达载体YepNP181,转化波氏假丝酵母,实现了Neo^r基因在波氏假丝酵母中的表达,使波氏假丝酵母转化子能在含G418的抗性培养基上生长从而建立了Neo^r基因－G418选择系统,为外源基因在波氏假丝酵母中表达创造了条件。     

ADK基因在酿酒酵母中的表达和ATP合成研究

采用基因工程技术,将催化ＡＴＰ合成的酶－ＡＤＫ的基因克隆进表达载体ＹＥｐＮ１８１Ｐ２获得重组质粒ＹＥｐＮ－ＡＤＫ,转化酿酒酵母ＧＲＦ１８后,ＡＤＫ基因获得表达。用重组菌株ＧＲＦ１８（ＹＥｐＮ＿ＡＤＫ）发酵合成ＡＴＰ其产率比对照菌株ＧＲＦ１８提高７５％。     

Mn~(++)及二甲基亚砜(DMSO)对限制酶HindⅢ识别顺序的影响

本文以质粒pBR322及噬菌体λcI857S7DNA 为底物研究了Mn~(++)及DMSO 对限制酶Hind Ⅲ对底物DNA 识别顺序的影响.在10mMTris-HClpH8.4,10mM MgCl_2,60mMNaCl 及7mM 巯基乙醇的正常反应条件下,HindⅢ在pBR322DNA 上只有一个切点,酶切后在凝胶电泳上可看到一条带.用10mM Mn~(++)代替Mg~(++)或在反应液中加入DMSO 进行酶切,在电泳上出现许多新的带.以λcI857S7DNA 为底物也得到类似的结果.新产生的片段可以用DNA 连接酶重新连接成线状分子.Mn~(++)及DMSO还能使Hind Ⅲ切割细菌本身的DNA.这些数据表明:Mn~(++)及DMSO 确实能降低Hind Ⅲ对底物的专一性,放松对识别顺序的要求.讨论了专一性降低的机制及其在核酸研究及基因工程中的意义。