甜菜BvM14-CCoAOMT基因的克隆、表达及生物信息学分析

以甜菜M14品系为试验材料,利用反转录PCR(RT-PCR)克隆获得了甜菜M14品系木质素合成相关基因咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(BvM14-CCoAOMT)的c DNA全长。生物信息学分析结果表明,BvM14-CCoAOMT基因具有咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因家族的典型结构域;系统发育分析表明,BvM14-CCoAOMT基因与松叶菊(Mesembryanthemum crystallinum)CCoAOMT基因亲缘关系较近。荧光定量PCR结果表明,BvM14-CCoAOMT基因在甜菜M14品系的茎中表达量最高,盐胁迫下BvM14-CCoAOMT基因在甜菜M14品系茎和叶中均显著上调表达。亚细胞定位研究发现BvM14-CCoAOMT蛋白在细胞各个亚细胞部位均有分布。本研究为进一步深入研究BvM14-CCoAOMT基因的功能奠定了理论与材料基础。     

甜菜M14品系特异表达基因BvM14-MADSbox启动子的克隆及序列分析

甜菜M14品系是带有白花甜菜染色体的栽培甜菜单体附加系,其染色体组成中除了包含18条栽培甜菜染色体外,还附加有白花甜菜第9号染色体,具有无融合生殖特性,无融合生殖能够固定杂种优势.在前期工作中,通过SSH、RACE等技术获得了甜菜M14品系特异表达基因BvM14-MADSbox的eDNA全长.通过6种限制性内切酶分别酶切M14品系基因组总DNA,再与相应接头连接,构建了6个DNA步移文库.根据基因BvM14-MADSbox cDNA序列设计引物,通过染色体步移技术克隆出该基因的上游DNA序列.经生物信息学分析,推测获得了BvM14-MADSbox基因上游1 718 bp的启动子序列,该序列含有启动子的基本元件TATA-box、CCAAT-box,和ARE、ERE、HSE、ABRE、CGTCA-motif等重要的顺式调控元件及一些光反应相关元件.该结果为今后BvM14-MADSbox基因的时空特异性表达调控机制奠定基础.     

甜菜BvM14-MADSbox基因启动子的组织特异性表达

MADS - box基因在植物的花器官和各种营养器官中均有不同形式的时空表达模式,行使不同功能.实验室前期获得了甜菜M14品系BvM14 - MADS box基因的特异启动子Pbm,并对其进行了瞬时表达.本试验利用含有重组载体pBI121 - Pbm - GUS的农杆菌转化烟草,对报告基因GUS在转基因烟草各组织表达特...     

甜菜M14品系Cystatin基因植物蛋白纯化表达载体的构建及转化烟草

植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一类具有提高植物对各种生物及非生物胁迫抗逆性的重要蛋白质。利用前期获得的甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的编码区序列构建了带有His标签的甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的植物蛋白纯化表达载体,并将其转化烟草,获得T0代阳性转基因植株,为下一步利用融合蛋白的His标签从转基因烟草中大量纯化甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂奠定了基础。     

利用SSH技术分析盐胁迫下甜菜M14品系的差异基因

甜菜M14品系是利用野生白花甜菜(Beta corolliflora Zoss.)与栽培甜菜(Beta vulgaris L.)进行种间杂交及回交获得的附加有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系,具有野生白花甜菜的一些优良性状。本研究利用抑制消减杂交技术,以未处理的甜菜M14品系叶片作为Driver,以500 mmol·L-1NaCl处理的甜菜M14品系叶片作为Tester,构建了盐胁迫下甜菜M14品系抑制消减cDNA文库;以地高辛为标记物,进行反向Northern Blot杂交筛选并测序,共获得盐胁迫下甜菜M14品系特异ESTs序列449个,组装后共得到58条Unigenes,并将测序所得结果进行了GO分类。该研究为进一步鉴定和挖掘甜菜M14品系新的优质基因资源奠定了基础。     

甜菜M14品系特异表达基因ESTs的生物信息学分析

甜菜M14品系具有无融合生殖特性,为了获得M14品系特异表达的基因,本实验室前期利用抑制消减杂交(SSH)和mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术对M14品系和能够进行有性生殖的栽培甜菜A2Y品系进行了基因特异表达研究,获得了298条M14品系特异表达基因的ES-Ts。对这些ESTs进行生物信息学分析并进行了GO分类,筛选出5条可能与基因表达调控和细胞周期调控相关的ESTs,为进一步获得这些基因的全长序列并研究其功能奠定了基础,也为今后能在甜菜M14品系中寻找并克隆与无融合生殖相关的基因提供了可靠的保证。     

利用生物信息学技术构建分析甜菜M14品系盐胁迫下参考转录组数据库

生物信息学(Bioinformatics)是一门计算机科学技术与生命科学的交叉学科,它通过综合利用生物学、计算机科学和信息技术揭示大量生物数据所赋有的生物学意义。目前利用生物信息技术对植物逆境环境下的基因组学、转录组学及蛋白质组学的数据挖掘,已成为功能基因组学的研究热点。甜菜M14品系具有野生白花甜菜(Beta corolliflora Zoss.)的耐盐性优良性状。为了对盐胁迫下的甜菜M14品系进行转录组分析及差异基因筛选,本研究构建了甜菜M14品系盐胁迫参考转录组文库,并对文库进行了测序以及数据的生物信息学分析,在参考转录组中鉴定得到54 843个Unigenes,并对这些Unigenes进行功能注释、GO及COG功能分类,为下一步研究甜菜M14品系耐盐基因资源挖掘奠定了重要基础。     

甜菜M14品系花器官蛋白质双向电泳体系的建立

双向电泳是目前唯一能将数千种蛋白同时分离与展示的技术.以具有野生白花甜菜优质基因资源的甜菜M14品系为材料,从植株取材、样品制备、蛋白质定量、上样量、双向电泳、染色、脱色等方面优化,构建了高效、稳定的甜菜M14品系花器官蛋白质双向电泳技术平台.结果证明所获得的凝胶图谱背景清晰,对比度高,重复性好,蛋白质点边缘平滑,并且...     

甜菜单体附加系M14与栽培甜菜蛋白质的SDS-PAGE比较分析

利用SDS- PAGE电泳比较分析了甜菜单体附加系M14与栽培甜菜在花蕾期蛋白水平上的差异.对甜菜单体附加系M14与栽培甜菜花蕾期蛋白的SDS-电泳图分析后,样品分别获得41与40条蛋白质条带,以栽培甜菜为对照甜菜单体附加系M14在花蕾期特异表达了3条蛋白质带,表达缺失了2个条带,初步推测其中可能有与M14进行无融合生殖相关蛋白质.     

用TRIzol试剂一步法提取甜菜花蕾中的总RNA

在花期分别对无融合生殖甜菜M14品系和进行正常有性生殖的二倍体甜菜A2Y品系的花蕾进行取样,采用TRIzol试剂一步法,分别提取了它们的总RNA,并测定了总RNA的浓度及纯度。讨论去除RNA酶的方法、具体操作的注意事项和TRIzol试剂一步法与其它方法相比的优越性。该方法为进一步进行mRNA差异显示分析和抑制消减杂交研究提供了总RNA的来源,也为今后能在甜菜中寻找和克隆与无融合生殖相关的基因提供了可靠的保证。     

盐胁迫下西伯利亚蓼蛋白质双向电泳分析及质谱鉴定

通过蛋白质双向电泳和质谱技术,对盐胁迫前后西伯利亚蓼的蛋白质组进行了比较分析.在pH3~10范围内,在西伯利亚蓼地下茎蛋白表达图谱中发现23个蛋白质点胁迫后的表达量与对照有明显差异(±2倍以上),其中包括一个新增蛋白点.对表达量变化较大的11个蛋白点进行质谱分析,并通过数据库检索进行蛋白质鉴定与功能预测,确定了4种蛋白质.其中的两种蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)和丙酮酸正磷酸二激酶(Pyruvate,ortho-phosphate dikinase)胁迫后高表达,说明地下茎细胞内正进行着旺盛的呼吸代谢,以提供维持植物生长发育以及抵抗外界胁迫所需的能量.     

基于转录组鉴定鼓槌石斛花温度胁迫响应基因

为研究鼓槌石斛花在温度胁迫应答方面的基因表达差异，对其在低温和高温胁迫下进行Illumina技术转录组测序．结果表明，组装获得321 734个单基因，其中141 464个基因在Nr,COG等4个数据库中获得注释．低温和高温胁迫分别识别了3 830,10 430个应答基因．在应答基因中，发现多个CBL,CBF和热激蛋白等基因成员．鼓槌石斛花低温胁迫应答可能与“损伤应答”“细胞外区”“血红素结合”等多个过程有关；高温胁迫应答可能与“缺水应答”“核”“ATP结合”等多个过程有关．这些差异基因为解析鼓槌石斛非生物胁迫应答机制提供帮助．     

杆状病毒SeMNPV Se29基因的克隆、表达与抗体制备

目的:克隆和表达甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multieapsid nueleopolyhedrovirus,SeMNPV) ORF29全长基因(Se29),制备SE29蛋白的多克隆抗体,方法:用PCR的方法扩增得到Se29基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌B...     

转录因子AP-2α与ACTN1、TES的相互作用

AP-2α是转录因子AP-2家族中的重要一员,与发育和细胞生长、分化和凋亡都有密切的联系.本文用酵母双杂交的方法筛选得到两个与转录因子AP-2α相互作用的蛋白,经测序鉴定分别为ACTN1与TES基因.在先前对AP-2α与TES基因分别克隆并在表达的基础上,进一步克隆并表达了ACTN1基因,并证实了ACTN1蛋白与AP-2α能够在体外相互作用.而且免疫共沉淀的结果表明在HeLa细胞系中过表达的AP-2α与TES蛋白能够处于同一复合体中.同时发现HeLa细胞系中,内源表达的ACTN1蛋白与GFP-TES有明显的共定位.结果提示这3种蛋白可能存在于同一个大的复合体中,通过这样的结合完成复杂的调节功能.     

斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析

为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因.将所得片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并通过IPTG诱导表达出GST-Hand2融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用western blotting和免疫组化的方法对抗体进行分析.分析表明:斑马鱼hand2基因成熟肽编码区含有627 bp,编码208个氨基酸,与人Hand2蛋白的同源性达到83%;IPTG诱导表达后,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71%,经GST纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.融合蛋白相对分子质量约为49 000.分析表明,制备的抗体具有很好的特异性.     

建立果蝇心脏发育候选基因CG3295的基因敲除系

果蝇CG3295基因是哺乳动物基因RMND5在果蝇中的同源物,其功能未知.利用P转座子敲除技术进行果蝇CG3295基因的敲除研究,将果蝇14234系的P转座子与△2-3系中的转座酶基因组合到同一个体,使P转座子在体内敲掉目的基因.从后代挑选不含P转座子和转座酶基因的500头雄蝇分别与缺失了CG3295基因的测交系交配,从后代筛选获得20个CG3295基因敲除候选系.进一步利用Hand-GFP系使候选系的心脏表达绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下根据候选系是否表现心脏突变表型鉴定敲除系,最后获得了12个表现心脏突变表型的CG3295基因敲除系.     

新型蛋白酶抑制剂基因hwtx-11在大肠杆菌中的克隆表达及杀虫功能研究

将化学合成的蜘蛛毒素蛋白酶抑制剂基因hwtx-11克隆至载体pGEX4T-1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.重组菌株在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的GST-HWTX-11融合蛋白的相对分子量约为33 kD.对重组菌株诱导表达后的产物进行生物活性测定,GST-HWTX-11融合蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exiguaHubner)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)在3d时的LC50分别为86.6μg/mL、119.4μg/mL;其与Cry1Ac对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫毒力也有明显的协同作用.     

水稻枝梗数性状的遗传研究进展

水稻穗部枝梗教影响稻谷产量.就穗部一、二次枝梗数性状的遗传研究进行了综述.研究表明枝梗数是受多基因控制的数量性状,具高的遗传力和变异度,其基因的表达受水分胁迫、不同年份的影响,并存在基因间上位性以及基因型与环境间互作;枝梗数与稻谷产量呈正相关:在早期世代和高代分别对一次枝梗数和二次枝梗数进行选择有较好效果.     

网络药理学结合GEO芯片探析黄连解毒汤治疗2型糖尿病的作用机制

运用网络药理学结合高通量基因表达(GEO)芯片数据探析黄连解毒汤治疗2型糖尿病的作用机制。基于GEO数据库筛选2型糖尿病与健康人差异基因，通过TCMSP筛选黄连解毒汤的活性成分及对应靶基因，取两者交集靶基因，借助R语言、Cytoscape软件中不同插件分别进行蛋白互作(PPI)及拓扑分析、基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，采用薛定谔Maestro软件进行分子对接验证。结果显示：GEO数据库中实验平台为GPL6947的数据集GSE29231符合研究要求，内含24个样本数据，通过筛选得到差异表达基因1 549个；根据口服生物利用度(OB)与类药性(DL)筛选出黄连解毒汤83个活性成分和131个靶基因；获得15个交集靶基因、9个核心活性成分和7个核心基因；分子对接显示槲皮素、金合欢素、黄芩素、芹菜素、山奈酚与IL6、EGFR、FOS、MDM2有较好的结合活性；KEGG富集分析得到包括脂质与动脉粥样和PI3K-Akt的66条信号通路。研究表明，通过网络药理学结合生物信息学探析，黄连解毒汤的主要活性成分可能通过IL6、EGFR、FOS、MDM2等靶点...     

斑马鱼HAS2基因的克隆、抗体制备及分析

HAS2是斑马鱼心脏发育的一个标志基因,为了利用斑马鱼动物模型进一步研究HAS2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼HAS2基因的片段.将所得的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-HAS2)转化大肠杆菌(E.coli)BL21,IPTG诱导表达GST-HAS2融合蛋白;通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体活性.生物信息学分析结果表明:斑马鱼HAS2基因的开放阅读框含有1658 bp,编码552个氨基酸;SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约为4.5×104;Western blotting分析表明,制备的抗体具有良好的特异性.