柳树NAC基因的克隆与表达模式分析

【目的】研究柳树重要抗逆转录因子基因家族,为揭示柳树抗逆分子机制提供理论依据。【方法】以‘苏柳2345’的转录组测序数据为基础,克隆了柳树NAC家族,并分析其序列结构、组织表达特异性以及不同胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆的两个柳树NAC转录因子基因分别命名为SlNAC1和SlNAC2。生物信息学分析表明:SlNAC1序列全长为1 126 bp,编码产物含343个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核;SlNAC2序列全长为1 139 bp,编码产物含291个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于叶绿体。两个基因均具有典型的NAM结构域及A、B、C、D、E 5个亚结构域,还包括共同的LPPG、YPNG 和DEE保守基序及NAC抑制结构域。系统进化树分析显示, SlNAC1基因与木薯亲缘关系最近,SlNAC2基因与茄子亲缘关系最近。定量PCR结果显示SlNAC1和SlNAC2均在叶片表达,根中没有表达,为叶片特异性转录因子。定量PCR结果显示SlNAC1基因在脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)处理24 h后显著上调,SlNAC2基因在聚乙二醇(PEG)、ABA和GA胁迫后显著上调。【结论】柳树SlNAC1基因在非生物胁迫下表达较为稳定,受ABA和GA胁迫诱导;SlNAC2受干旱、ABA和GA胁迫诱导,受影响明显高于SlNAC1,不受乙烯剂(ETH)胁迫影响。推测SlNAC1和SlNAC2参与GA、ABA信号传导,可能不参与ETH的信号途径。     

山桐子IpSAD基因家族分析及功能鉴定

【目的】硬脂酰-ACP Δ⁹脱氢酶(stearoyl-ACP Δ⁹ desaturase,SAD)是决定脂肪酸组成的关键酶,分离和鉴定木本油料植物山桐子(Idesia polycarpa)的SAD基因,可为遗传改良山桐子油的脂肪酸组成提供基因资源。【方法】 使用 HMM 和 Blastp 鉴定山桐子全基因组中的SAD家族成员;利用MEGA X、MEME和PlantCare等在线软件对其蛋白质理化性质、系统发育关系、基因结构、保守基序和启动子顺式调控元件等进行分析;使用MCSCANX分析山桐子和毛果杨SAD基因之间的共线性关系;基于RNA-seq数据,分析IpSAD各成员的表达模式,通过病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)快速验证它们的生物学功能。【结果】 ①在山桐子基因组中共鉴定到7个IpSAD基因(IpSAD1~7),多重序列比对结果显示各成员间序列相似度较高且结构域保守;②系统发育分析表明,IpSAD成员可以分为3个亚组,与拟南芥SAD家族的分类结果一致,拟南芥单不饱和油酸合成关键基因AtSSI2与山桐子IpSAD2、IpSAD3、IpSAD4的亲缘关系较近;③启动子区域顺势调控元件预测结果显示IpSAD基因的启动子含有光反应、脱落酸响应等顺式调控元件;④IpSAD基因按其组织表达模式可分为3类,第1类和第2类成员在大部分组织中表达量较低,而第3类成员在所有组织中表达量均较高。⑤沉默IpSAD基因使叶片的油酸含量显著降低,其中IpSAD3的沉默可使油酸含量下降76%。【结论】 明确了IpSAD家族各成员的基本特征,确定了它们对于油酸合成的生物学功能,并为山桐子油脂生物合成调控机制研究奠定了基础。     

大青杨PuZFP103基因的序列特征及逆境胁迫的表达分析

【目的】通过研究大青杨(Populus ussuriensis)PuZFP103基因的序列特征及其在不同组织部位、激素处理与胁迫应答中的表达特性,为揭示PuZFP103在大青杨生长发育中的功能提供依据。【方法】利用各种生物信息学方法对PuZFP103基因进行分析,采用实时荧光定量 PCR(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qpCR)技术分析PuZFP103基因在不同组织、激素处理与胁迫应答中的表达模式,并用基因枪轰击法进行亚细胞定位分析。【结果】生物信息学分析发现,PuZFP103 CDS序列全长504 bp,编码168个氨基酸。分析得出PuZFP103蛋白含有ZnF-C2H2结构域,其二级结构中α螺旋、无规则卷曲和β-折叠分别占24%、84%和1%。进化树构建图显示,其与同属毛果杨、胡杨、毛白杨及番木瓜聚类到一起,亲缘关系最近。RT-qPCR分析结果显示,NaCl、脱落酸(abscisic acid, ABA)和PEG 6000胁迫处理后PuZFP103基因在大青杨叶和根中的表达量在大多数时间内相对于未处理都有所提高。另外,PuZFP103基因定位于细胞核中。【结论】PuZFP103基因在NaCl、ABA和PEG 6000胁迫处理后呈正调控的应答模式,可能参与了大青杨对渗透胁迫的代谢途径或信号传导,属于逆境胁迫下的调控因子。本研究初步证明大青杨PuZFP103基因与胁迫响应相关,但是关于其信号传导与调控机制需进一步研究。     

马尾松PmCBL3基因的克隆及其表达分析

【目的】为明确马尾松(Pinus massoniana)CBL基因结构特征及干旱胁迫下的表达特性,探讨该基因在马尾松抗旱调控过程中的生物学功能。【方法】以马尾松优良家系为试材,采用RT-PCR和RACE方法克隆马尾松CBL基因全长cDNA,运用生物信息学方法,分析其蛋白质性质和亲缘关系,利用荧光定量PCR分析干旱胁迫下的基因表达特性。【结果】获得马尾松的一个CBL同源基因,命名为PmCBL3,该基因cDNA序列全长1 035 bp,包括681 bp的完整开放阅读框,编码226个氨基酸。PmCBL3蛋白含4个EF-hand功能域,且相邻EF-hand功能域之间的氨基酸数目非常保守,属于EFh家族蛋白。系统进化分析表明:该蛋白与其他植物CBL同源性达62%～98%,其中与北美云杉(Picea sitchensis)CBL亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,PmCBL3在马尾松根中表达量最高,茎和叶次之; 干旱第15天表达量最大,随干旱胁迫加剧,表达量逐渐降低。【结论】PmCBL3基因属于CBLs家族,与北美云杉亲缘关系最近。该基因响应干旱胁迫,推测其可能参与马尾松干旱逆境的应答调控。     

毛果杨苯丙氨酸解氨酶活性比较及肉桂酸制备

【目的】苯丙氨酸解氨酶(PAL)在苯丙烷代谢途径中具有重要作用,PtrPAL基因的挖掘、酶学性质分析和应用为毛果杨苯丙烷代谢途径的研究和肉桂酸(t-ca)合成提供参考。【方法】基于基因组注释信息,挖掘毛果杨PtrPAL基因,进行原核表达和酶学性质分析。以L-苯丙氨酸(L-Phe)为底物,通过全细胞催化合成t-ca。【结果】通过挖掘毛果杨基因组得到了5个PtrPAL基因,系统发育树分析表明其在进化上分为两组。PtrPAL3和PtrPAL4来自不同进化分支,选取其进行原核表达和酶学性质分析。镍柱纯化后的重组蛋白rePtrPAL3和rePtrPAL4最适温度分别是55 ℃和60 ℃,最适pH分别是8.5和8.0,比酶活分别为3.363和3.381 U/mg,且均具有微弱的酪氨酸解氨酶活力。重组蛋白的动力学分析表明,rePtrPAL3对L-Phe的亲和力更高。将rePtrPAL3应用于L-Phe脱氨生产t-ca,全细胞催化7 h可产生104 mmol/L t-ca。【结论】具有不同转录特异性的两种rePtrPAL酶学性质接近,但rePtrPAL3表现出更高的催化效率,更适合用于t-ca的生物合成。而且,其产量高于文献报道的28 mmol/L水平,具有良好的应用潜力。     

杉木ClWRKY44基因克隆及其表达特性分析

【目的】以杉木幼叶为试验材料,通过克隆杉木ClWRKY44基因,分析其表达特性,为揭示杉木抗逆生理的分子机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR技术克隆杉木ClWRKY44 基因,对其进行生物信息学分析和亚细胞定位研究,并利用实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。【结果】杉木ClWRKY44 基因的开放阅读框(ORF)为1 776 bp,编码591个氨基酸,具有WRKY结构域。系统进化树分析结果显示ClWRKY44 基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)ATWRKY44 的亲缘关系较密切,其在杉木的不同器官(叶、根、茎) 中均有表达,嫩叶中的表达量最高,茎中次之,根中最低。低温胁迫处理6 h,ClWRKY44 基因相对表达量最高,约是对照组的79.8倍。干旱胁迫处理24 h,ClWRKY44 基因在高浓度干旱胁迫处理下的相对表达量最高,约是对照组的46.6倍。【结论】杉木ClWRKY44基因编码的蛋白质序列与拟南芥ATWRKY44的同源性很高,在调控植物逆境胁迫应答过程中可以发挥功能,为杉木幼苗生长发育的适应性提供参考。     

氰丙氨酸合酶在乙烯诱导杨树耐盐中的作用

【目的】探讨木本植物线粒体β-氰丙氨酸合成酶在乙烯诱导的交替呼吸氧化酶(AOX)途径对盐胁迫响应中的作用。【方法】选取盐胁迫下‘南林895’杨叶片,利用HPLC测定氨基环丙烷羧酸(ACC,乙烯前体)含量,实时荧光定量PCR分析基因表达,比色法测定半胱氨酸水平。【结果】盐胁迫使杨树幼苗叶片ACC积累,乙烯合成相关酶(ACS7和ACO3)、氰丙氨酸合酶(CYS C1),以及腈水解酶(NIT4)等基因显著上调表达,同时伴随着线粒体交替呼吸氧化酶(AOX1b)基因的上调和细胞色素c氧化酶(COX6b)基因下调表达。水杨基氧肟酸(SHAM)预处理导致AOX1b基因表达被抑制,电解质渗透率(EL)和丙二醛(MDA)含量上升,但不影响CYS C1表达。而乙烯合成抑制剂氨基氧乙酸(AOA)了抑制CYS C1和盐胁迫诱导的AOX1b基因的表达,并增加EL和MDA含量。此外,AOA恢复盐胁迫减少的半胱氨酸含量,而SHAM和抗霉素A(AA)均无此效应。【结论】杨树叶片CYS C1参与了乙烯激发的耐盐响应,但乙烯诱导的交替呼吸氧化酶(AOX)并未位于CYS C1上游而发挥作用。     

团花树NcIRX9基因在木聚糖生物合成中的功能保守性

【目的】木聚糖是双子叶植物中次生壁半纤维素的主要成分,在维持植物次生壁的完整性和植物生长方面有重要作用。在木本植物中,木聚糖对木材性质和生物质能源的利用有重要影响。本研究探索我国南方速生树种团花树NcIRX9基因及其在木聚糖合成中的功能。【方法】结合生物信息学方法,分析团花树NcIRX9亲缘关系和蛋白质结构;构建 YFP( 黄色荧光蛋白) 融合蛋白,观察其亚细胞定位;通过qRT-PCR分析团花树NcIRX9基因的表达特性及组织特异性;通过切片显微观察、化学免疫、单糖分析及H¹-NMR分析团花树NcIRX9基因在拟南芥突变体irx9体内的功能。【结果】团花树NcIRX9在进化上保守,其N端存在一个信号肽,定位于高尔基体内,与拟南芥AtIRX9密切相关。NcIRX9基因在根、茎、叶、木质部、韧皮部均有表达,且在木质部中的表达量较高。互补分析表明NcIRX9能部分互补拟南芥突变体irx9表型,是AtIRX9的直系同源基因。此外,本研究还表明在拟南芥突变体irx9过度表达NcIRX9木糖含量升高,侧链信号增强,与此同时还原末端侧链信号增强。【结论】团花树NcIRX9基因行使与拟南芥AtIRX9相似的生物学功能,与木聚糖的合成密切相关。     

Th2CysPrx基因提高酿酒酵母多种胁迫耐受性研究

【目的】过氧化还原蛋白是生物体调节体内氧化还原系统的一种重要蛋白质,在植物生长代谢中起重要作用。前期研究发现过表达刚毛柽柳Th2CysPrx基因的烟草和柽柳中4种抗氧化酶基因(ThGSTZ1、ThGPX、ThSOD和ThPOD)的表达水平上调, 转基因植株的NaCl胁迫耐受性提高。本实验探究Th2CysPrx基因除了响应NaCl胁迫应答,是否还参与其他盐胁迫和其他胁迫的应答。 【方法】将Th2CysPrx构建到pYES2酵母表达载体上,转化到酿酒酵母INVSC1细胞中,分析比较重组酵母(pYES2-Th2CysPrx)和对照酵母(pYES2)细胞在各种非生物胁迫后的生长情况。【结果】过表达Th2CysPrx基因的重组酵母细胞在低温、KCl和LiCl胁迫后存活率与对照相比差异不显著;但H₂O₂、NaCl或NaHCO₃胁迫后酵母细胞的存活率显著提高。此外,高于0.5 mol/L山梨醇或高温(达到44 ℃),或低于质量分数0.007% CdCl₂胁迫后,过表达Th2CysPrx基因能显著提高重组酵母的细胞存活率。【结论】Th2CysPrx基因可以显著增强酵母细胞对NaCl和NaHCO₃胁迫的耐受能力,以及特定的渗透胁迫、高温胁迫、氧化胁迫和重金属胁迫的耐受能力,但对低温、KCl和LiCl胁迫耐受能力无明显影响。     

杨树GABA支路3个基因家族的鉴定和表达分析

【目的】 γ-氨基丁酸(GABA)与植物的生长发育有着密切的联系。结合前期对GABA抑制杨树不定根发育的研究,对GABA支路基因家族的特征和表达模式进行研究,为进一步解释其在不定根发育中的作用奠定基础。【方法】从银白杨(Populus alba)×P. glandulosa ‘84K’(‘84K’杨)基因组中鉴定出GABA支路的PopGAD、PopGABA-T和PopSSADH 3个基因家族成员,并利用生物信息学方法分析其特征,以及与其他物种相关基因家族的亲缘关系;利用qRT-PCR研究外源GABA及其降解抑制剂vigabatrin(VGB)对各基因表达的影响。【结果】①PopGAD、PopGABA-T和PopSSADH 3个基因家族成员数量依次为6、2和2个,启动子序列中主要包含与光、激素和环境等响应相关元件。②系统进化分析表明,PopGAD家族中PopGAD6与家族其他成员亲缘关系较远;PopGABA-T和PopSSADH家族中的两个基因成员亲缘关系较近。③基因表达分析表明,不定根生长过程中GABA支路基因总体上在根中表达量高于茎和叶。外源GABA或VGB处理对PopGAD和PopGABA-T两个基因家族成员在根、茎和叶中的表达量影响程度不同,但对 PopSSADH基因家族的表达则无明显影响。【结论】 GABA支路3个基因家族在‘84K’杨树响应光、激素和环境胁迫等方面具有重要作用。外源GABA和VGB处理对PopGAD和PopGABA-T家族成员的影响较大,并且均在根中表达量最高,表明这两个基因家族在不定根生长过程中发挥着重要调控功能。这为深入解析GABA在树木不定根发生中的作用机制奠定了基础。     

刚毛柽柳Th2CysPrx基因的互作蛋白及其表达模式分析

【目的】使用酵母双杂交系统研究刚毛柽柳中获得的2CysPrx(硫氧还蛋白过氧化物酶)基因(命名为Th2CysPrx)及编码蛋白的功能。【方法】通过酵母双杂交系统对该基因编码蛋白的互作蛋白进行筛选,进一步利用qRT-PCR 技术分析NaCl 和PEG₆₀₀₀ 胁迫下刚毛柽柳叶组织和根部组织中Th2CysPrx 基因与其互作蛋白基因的表达模式。【结果】酵母双杂交系统筛选获得了4 个可能与Th2CysPrx 互作的蛋白,分别为丙氨酸-乙醛酸转氨酶2(alanine-glyoxylate aminotransferase 2,ThAGT2)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,ThMDH)、黄酮醇合酶(flavonol synthase,ThFLS)和扩展蛋白(expansin,ThEXP)。基因表达分析结果显示:盐胁迫下,柽柳叶和根中,Th2CysPrx和ThAGT2 基因的表达模式基本一致; 而干旱胁迫下,Th2CysPrx和ThAGT2 基因在叶和根中具有相同的表达模式。【结论】在盐和干旱胁迫下,ThAGT2 基因与Th2CysPrx 表达模式均趋于一致,表明Th2CysPrx 基因均可能通过与ThAGT2 基因的互作共同参与抗逆过程,为进一步研究Th2CysPrx 基因的抗逆机制,以及与其他抗逆基因的关系提供了依据。     

假俭草EoNLA基因克隆与其转基因拟南芥在不同磷水平下的表型鉴定

【目的】磷元素是植物必需的大量营养元素,在植物的生长发育中必不可少。NLA(nitrogen limitation adaptation)蛋白是一种RING型E3泛素连接酶,参与磷转运蛋白的泛素化调控,在植物体的磷素平衡调节方面发挥重要作用。以假俭草这类天然适应低磷土壤条件的植物为研究材料,通过研究假俭草EoNLA的磷高效转运分子机制,为草坪草适应酸性土壤生境的磷高效转运分子育种和栽培调控提供理论依据。【方法】通过RACE方法克隆获得EoNLA基因,应用生物信息学分析确定基因的全长序列及编码氨基酸序列,采用原生质体瞬时表达体系确定EoNLA蛋白膜定位;通过qRT-PCR方法分析EoNLA基因低磷诱导下的表达模式,并通过农杆菌介导转化拟南芥进行基因功能鉴定。【结果】EoNLA基因序列全长1 353 bp,编码一个长度为331个氨基酸的蛋白。该蛋白具有NLA蛋白典型的RING结构域和SPX结构域,EoNLA蛋白定位于细胞膜,EoNLA基因在根组织的表达量显著高于在茎和叶的表达。【结论】EoNLA基因具有根组织表达特异性,且基于拟南芥转基因植株进行的功能鉴定,进一步显示EoNLA基因具有磷素调控相关的功能。     

唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2基因克隆及表达分析

【目的】唐古特白刺(Nitraria tangutorum)是土壤荒漠化和盐碱化防治的先锋植物,对高盐和干旱有极强的适应能力,植物CBL基因作为钙离子感受器,在植物逆境应答及发育过程中具有重要功能。以盐生植物唐古特白刺为材料,开展唐古特白刺CBL基因克隆及表达分析,以深入了解唐古特白刺的抗逆分子机制。【方法】根据唐古特白刺的转录组数据,设计特异性引物,克隆两个CBL基因,并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位鉴定。使用实时荧光定量PCR技术分析盐胁迫条件下唐古特白刺CBL基在叶片中的表达模式。【结果】克隆鉴定了唐古特白刺的NtCBL1、NtCBL2基因,NtCBL1基因cDNA编码区长度为642 bp,可编码213个氨基酸,蛋白质分子质量为52.77 ku,分子式为C_{1 971}H_{3 302}N₆₄₂O₈₃₆S₁₀₆;NtCBL2基因cDNA编码区长度为681 bp,可编码226个氨基酸,蛋白质分子质量为26.10 ku,分子式为C_{1 179}H_{1 832}N₂₉₈O₃₅₆S₇。亚细胞定位预测和鉴定结果显示NtCBL1、NtCBL2蛋白均定位于细胞膜上。在胁迫、干旱迫、冷胁迫处理下,NtCBL1、NtCBL2基因均表现出不同程度的变化,而NtCBL1基因的变化更为明显,推测其在盐、干旱胁迫中发挥重要作用。【结论】从唐古特白刺中克隆出NtCBL1、NtCBL2基因,发现NtCBL1基因在盐胁迫下表达量明显上升,而NtCBL2基因变化不大。结果表明NtCBL1基因可能参与唐古特白刺的盐、干旱胁迫响应,而NtCBL2基因在冷胁迫下起一定作用。     

3个白桦细胞色素P450基因生物信息学及表达分析

【目的】研究白桦细胞色素P450基因表达的组织特异性,以及在茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA₃)、脱落酸(ABA)、乙烯利和伤害处理下的基因表达模式。【方法】筛选白桦转录组,获得3个BpCYP450 基因,分别命名为BpCYP4、BpCYP5、 BpCYP14,利用生物信息学分析BpCYP450蛋白的分子结构特征及其与其他物种CYP450蛋白的亲缘关系。采用QRT-PCR技术,对白桦BpCYP450组织特异性、激素信号及伤害诱导下的表达特征进行分析。【结果】生物信息学结果表明BpCYP4、BpCYP5、BpCYP14 cDNA序列长度分别为1 569、1 584和1 530 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),分别编码522、527和509个氨基酸,均为亲水性跨膜蛋白,主要定位于叶绿体。白桦BpCYP450与百脉根、扁豆及豌豆等豆科植物CYP450蛋白亲缘性较高。组织特异性分析结果显示,3个BpCYP450 基因在叶和根中表达较高,茎中较低。激素信号及伤害诱导结果表明,3个BpCYP450基因不同程度地响应MeJA、SA、GA₃、ABA、乙烯利激素信号及伤害诱导。【结论】3个BpCYP450基因均为CYP450基因家族的新成员,具有组织特异性及激素诱导表达特性,可能在白桦生长发育、抵御胁迫及代谢物合成中发挥重要作用。     

刚毛柽柳ThPCS1基因克隆与镉胁迫应答分析

【目的】探究刚毛柽柳(Tamarix hispida)植物络合素合酶(phytochelatin synthase,PCS)基因ThPCS1的镉胁迫应答功能。【方法】通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对刚毛柽柳ThPCS1基因进行克隆;通过BioEdit、MEGA 5.0等软件对ThPCS1蛋白进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析镉(Cd)胁迫条件下ThPCS1基因在柽柳根和叶中的表达水平;构建pROKII-ThPCS1过表达载体,通过瞬时侵染技术获得转ThPCS1基因柽柳,分析比较转基因和对照柽柳Cd胁迫应答相关生理指标和生理染色情况。【结果】从刚毛柽柳转录组数据中分离出ThPCS1基因的全长转录组序列,预测该基因的开放阅读框为1 581 bp,编码526个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为130.75 ku,理论等电点pI为5.0。保守结构域的多重比对分析结果均显示ThPCS1蛋白在N端具有PCS结构域。RT-qPCR结果显示在镉胁迫条件下,ThPCS1基因在柽柳根中被诱导表达,且呈现出组织特异性的表达模式。对镉胁迫处理后的刚毛柽柳ThPCS1转基因植株和对照植株相关生理指标进行测定,结果显示,同对照植株相比,转基因植株的活性氧和镉离子含量降低,细胞膜损伤减小。【结论】刚毛柽柳ThPCS1基因在根中的表达明显受到镉胁迫诱导,可能参与了刚毛柽柳对镉胁迫的应答。本研究初步证明刚毛柽柳ThPCS1基因可能提高了转基因植物的耐镉能力,是一个耐镉分子育种的候选基因。     

核桃V-ATPase c亚基基因(JrVHAc4)的克隆和抗旱功能分析

【目的】V-ATPase是植物逆境响应的重要酶,有必要了解V-ATPase相关亚基参与核桃响应逆境胁迫的功能机制。【方法】从‘香玲’核桃转录组中克隆获得1条V-ATPase c 亚基基因(命名为JrVHAc4),通过分析启动子预测其逆境响应功能。对JrVHAc4基因进行干旱胁迫下的表达分析,同时构建JrVHAc4酵母表达载体转入酵母表达系统研究其抗旱功能。【结果】JrVHAc4基因开放读码框(ORF)全长495 bp,拟推导的蛋白分子量为16 527.61 u,包含164个氨基酸,理论等电点为8.62; 其上游1 047 bp启动子包含MYC、DOF、MYB等与干旱响应相关的顺式作用元件。干旱胁迫下,JrVHAc4基因在核桃叶和根中均被显著诱导,并存在差异。对JrVHAc4转基因酵母进行不同浓度甘露醇胁迫,与对照酵母相比,发现JrVHAc4基因的表达能显著提高转基因酵母的生长活性。【结论】JrVHAc4基因能响应干旱胁迫,并能提高酵母的抗旱能力,JrVHAc4可作为核桃抗逆重要候选基因。     

白桦BpGRAS1基因的克隆及耐盐功能分析

【目的】 GRAS转录因子是植物特有的转录因子家族之一,在植物响应盐、干旱等非生物胁迫中发挥重要的调控作用。从白桦(Betula platyphylla )中克隆GRAS转录因子基因,研究其耐盐功能,为研究木本植物GRAS转录因子的抗逆机制奠定理论基础。【方法】 在白桦转录组数据库中获得一个GRAS转录因子基因,命名为BpGRAS1 (GenBank 登录号: MN117546.1)。利用生物信息学进行多序列比对、构建进化树。分别构建植物过表达(pROKⅡ-BpGRAS1) 及抑制表达(pFGC5941-BpGRAS1) 载体。利用农杆菌介导高效瞬时遗传转化体系获得BpGRAS1基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE) 及对照 (WT) 白桦植株。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR) 技术分析盐胁迫下OE、IE及WT植株中BpGRAS1基因的表达情况,鉴定转基因植株中BpGRAS1的表达效率是否响应盐胁迫。在盐胁迫下比较了BpGRAS1基因瞬时过表达、抑制表达及对照白桦植株的电解质渗透率、失水率、丙二醛(MDA) 含量、过氧化物酶 (POD) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 活性。【结果】 BpGRAS1基因的开放阅读框为1 425 bp,编码 474个氨基酸。BpGRAS1具有GRAS家族的序列特征,在C端的氨基酸序列相似度较高,与AtSHR亲缘关系较近。盐胁迫处理下,BpGRAS1的表达量升高,过表达植株中表达量高于对照,抑制表达植株中表达量低于对照,说明BpGRAS1受盐胁迫诱导,成功获得过表达及抑制表达植株。过表达BpGRAS1基因能降低白桦在盐胁迫下的电解质渗透率、失水率及 MDA 的积累,并显著增强了 POD 和 SOD 酶的活性,从而提高转基因植株的耐盐性。【结论】 BpGRAS1基因响应盐胁迫,过表达BpGRAS1基因降低了盐胁迫下植株细胞受损程度,通过增强POD 和 SOD 活性提高白桦的耐盐能力。     

杨树根特异性表达β-果糖苷酶抑制子的功能性验证

【目的】植物细胞壁转化酶(CWI)和液泡转化酶(VI)是分配碳水化合物、维持库器官强度和环境胁迫应答的重要因子。大量证据表明CWI和VI由β-果糖苷酶蛋白抑制子的翻译后调控机制介导。然而,关于C/VIFs家族的分子和遗传学基础以及生化特性研究目前还不清楚。【方法】应用生物信息学分析基因结构特征和系统进化关系,并利用实时荧光定量PCR研究转录本在组织中的丰富度。同时,结合烟草叶片瞬时和拟南芥遗传转化法的荧光表达,以及重组蛋白系统分别对PtC/VIF1亚细胞定位特征和体外抑制活性进行深入鉴定。【结果】共39个PtC/VIF候选编码基因家族被筛选出来。PtC/VIF1在根中具有高转录水平;共聚焦显微镜观察证实PtC/VIF1是分泌到细胞外空间。重组蛋白活性检测表明其对CWI蛋白具有特异的亲和抑制活性,说明PtC/VIF1是定位于质外体的β-果糖苷酶抑制子。【结论】对C/VIF编码基因家族生物信息学分析和PtC/VIF1在杨树中的功能性鉴定属于首次报道,可为后期进一步深入探索该基因的生理学作用和参与抗病防御路径以及环境胁迫响应的潜在功能提供理论基础和研究依据。     

转BpmiR156基因白桦株系的耐盐性分析

【目的】探究植物年龄响应因子miR156的耐盐功能。【方法】以BpmiR156过表达白桦株系和非转基因对照株系为材料,通过PCR及qPCR分析各转基因株系中外源BpmiR156的稳定性及表达情况;同时对转基因及对照株系进行NaCl胁迫处理,调查胁迫后盐害指数、生理指标及生长速度。【结果】各转基因株系中外源BpmiR156已整合到白桦基因组中,且表达量显著高于非转基因对照株系;NaCl胁迫后,转基因株系的H₂O₂、丙二醛(MDA)含量及盐害指数高于对照株系,生长速度变慢。【结论】BpmiR156基因在白桦中稳定表达,BpmiR156基因过表达白桦株系与对照株系相比,在盐胁迫后盐害指数增加,生长速度变慢,膜系统损伤更严重,说明转入miR156基因在一定程度上降低了白桦的耐盐性。     

白桦BpTCP8基因生物信息学及表达特性分析

【目的】通过研究白桦BpTCP8基因的序列特征及其在不同组织部位、激素处理与胁迫应答中的表达特性,为揭示BpTCP8在白桦生长发育中的功能提供依据。【方法】利用生物信息学方法对BpTCP8基因进行分析,采用实时荧光定量 PCR 技术分析BpTCP8基因在不同组织部位、激素处理与胁迫应答中的表达特性。【结果】生物信息学分析发现,BpTCP8含有TCP家族高度保守的bHLH结构域;qRT-PCR分析结果表明,白桦BpTCP8在发育和衰老初期的叶片中表达量高,并在深裂型叶片、顶芽、木质部、韧皮部中都上调表达。在激素(GA₃、ME-JA、ABA)与非生物胁迫(PEG、NaCl、CdCl₂、NaHCO₃)处理下,BpTCP8都对其产生了相应的应答。【结论】BpTCP8基因可能参与到了白桦叶片成熟、叶型、顶芽、木质部和韧皮部的生长过程中;该基因在GA₃、JA处理中呈现正调控的应答模式,并且可能通过ABA信号途径影响植物抗旱,耐盐、碱、重金属胁迫等。