水稻胁迫应答基因OsABI8的克隆与表达分析

利用拟南芥abscisic acid-insensitive8(ABI8)基因的序列在NCBI核酸数据库中检索到水稻ABI8的序列信息,并设计特异性引物,以水稻cDNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出水稻ABI8 cDNA序列.将所得序列片段克隆到T载体上并进行序列测定,结果显示,该基因全长1 666 bp,开放阅读框927 bp,编码一个308个氨基酸的蛋白.该蛋白序列与普通小麦、一粒小麦、玉米、高粱、拟南芥菜等植物的ABI8基因序列高度同源,分别达到86.1%、86.4%、89.6%、90.3%及72.5%的一致性.利用荧光定量PCR法检测了QsABI8基因在ABA激素、干旱和盐胁迫下的表达谱,发现胁迫下植物积累更多的QsABI8 mRNA.     

利用大麦寡核苷酸芯片进行小麦苗期叶片热胁迫基因表达谱分析

植物感受热胁迫时基因表达发生变化，而这些差异表达的基因对植物耐热性起着至关重要的作用.为揭示小麦热胁迫响应的分子机理，以38℃热胁迫的小麦幼苗为处理组(HS)，同期未经处理的小麦幼苗为对照组(CK)，分别提取叶片RNA与Affymetrix Barley1基因芯片杂交.杂交结果显示，在总共22840个探针中，对照组(CK)和热胁迫组(HS)共检测到8486个阳性探针，占总探针数的37.15%.利用半定量RT-PCR技术对11个差异表达基因的表达模式进行验证，发现10个基因与芯片的表达类型完全一致. 利用Gene Ontology的GO information对差异表达的基因进行了分类，表明差异表达的基因涉及逆境胁迫、信号转导、物质运输、光合作用、蛋白代谢、脂肪代谢、碳水化合物代谢等多个方面.其中有大量热激蛋白和分子伴侣相关基因上调表达.上调表达的热激蛋白包含热激蛋白各个家族，且上调表达的平均倍数明显高于其他基因的上调倍数.另外泛素—蛋白酶体通路中的多个关键酶的基因也发生了差异表达，预示着负责蛋白质选择性降解的泛素—蛋白酶体通路也参与了植物对热胁迫的应答机制.     

PMI基因为筛选标记的抗旱表达载体构建

利用PCR克隆了大肠杆菌(Escherichia coli.)6-磷酸甘露糖异构酶(pmi)并进行了序列测定,序列分析表明,该片段与已经报道同源性为98.9%,推导的氨基酸序列与报道的同源性为100%.将该基因替换植物表达载体pCAMBIA130l中的潮霉素抗性基因,成功构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301DP,为抗旱转基因育种奠定了物质基础.     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

龙眼FLO/LFY同源基因cDNA片段的克隆

根据不同植物FLO/LFY同源基因3'端保守序列,设计简并引物,运用RT-PCR技术在龙眼花芽总RNA中扩增得到长度为408bp的cDNA片段,命名为lonFLO.序列分析表明,该片段与金鱼草FLO、苹果AFL2、AFL1、拟南芥LFY有较高的核苷酸同源性,分别达98.8%,81.6%,81.1%和76.2%.     

多基因双T-DNA植物表达载体的构建及拟南芥转化

多基因植物表达载体用于植物遗传转化是培育具有多种优良品质作物的有效策略. 双T-DNA系统是实现筛选完成后选择标记基因删除的一种简便可行的方式. 为培育高度抗逆或去除标记基因的农作物，构建了多基因双T-DNA植物表达载体2T-bbgdD，其中含有一个抗除草剂基因bar, 3个抗逆相关基因(DREB1A, Na+依赖性Pi转运体基因（d5）, betA)和一个报告基因gfp. 利用农杆菌介导法将该载体转入拟南芥，获得了多基因共转化及去除标记基因的转基因拟南芥. 可将此植物表达载体进一步用于作物的遗传转化.     

利用TRV过表达和沉默系统验证植物油脂合成相关基因的功能

为探究烟草脆裂病毒过表达和沉默系统进行油脂相关基因研究的可能性,该研究克隆了拟南芥的WRI1和FAD2基因,分别构建了TRV过表达和沉默载体. 利用瞬时侵染技术侵染本氏烟草,取材料进行RT-PCR和脂肪酸含量检测. 结果显示在过表达WRI1基因的本氏烟草中,侵染叶和非侵染叶的WRI1基因及其相关参与脂肪酸合成基因ACP1、KAS1和BCCP2等都有明显上调,且脂肪酸含量检测结果显示分别增加16%和28%. 在沉默FDA2基因的本氏烟草植株中,发现多不饱和脂肪酸含量分别减少约25%和24%. 因此,利用TRV系统对油脂相关基因进行研究是可能的.     

棉花硫氧还蛋白基因GhWCRKC2-5参与开花调控的功能研究

目的 FLOWERING LOCUS T (FT)位于开花调控网络的中心,编码成花激素,不仅调控植物开花转变,还参与调控植物多方面的生长发育。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)在植物的逆境胁迫中发挥着重要的生物学功能。方法我们前期克隆了一个棉花FT同源基因Gh FT1,利用酵母双杂技术筛选到一个与Gh FT1蛋白互作的硫氧还蛋白Gh WCRKC2-5。本研究采用RT-PCR技术从陆地棉中扩增了Gh WCRKC2-5基因的开放阅读框c DNA。该基因编码一个203个氨基酸的短肽,含有WCRKC保守氨基酸基序,为非典型的Trx。全基因组分析表明棉花中含有46个非典型的Trxs,系统进化分析显示Gh WCRKC2-5与Theobroma cacao的Tc WCRKC亲缘关系最近。q RT-PCR分析表明Gh WCRKC2-5基因在棉花根和花中表达较高,在茎、叶和顶端分生组织中表达较低;在纤维不同发育时期,Gh WCRKC2-5基因表达呈现出降低-升高-降低的趋势,在棉花开花后25 d时的纤维表达最高。结果在拟南芥中过量表达Gh WCRKC2-5基因,转基因拟南芥明显比野生型早花,并且转基因拟南芥的FT及开花通路中关键基因SUPPESSOR OF OVER EXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1)明显上调表达。利用病毒介导的基因沉默技术干扰Gh WCRKC2-5基因的表达,Gh WCRKC2-5沉默的植株比对照植株开花时间晚。结论 Gh WCRKC2-5基因在棉花的开花转变中起着重要作用,本研究为深入分析棉花开花调控机理奠定基础。     

毛白杨果胶甲酯酶PtoPME34-1调控植物抗旱性研究

为了探究林木植物中果胶甲酯酶PME的功能,本研究中,我们从毛白杨中克隆出拟南芥PME34的同源基因PtoPME34-1,阐述了该基因在毛白杨中的生物学功能.生物信息学分析表明,毛白杨PtoPME34-1基因与毛果杨PtrPME34-1序列相似性为100%,与拟南芥AtPME34序列相似性为93%.组织特异性表达分析显示PtoPME34-1基因在所有组织都有表达,在基部茎、木质部的表达量较高,在老叶表达量最低.蛋白亚细胞定位结果显示,绿色荧光蛋白GFP标记的PtoPME34-1-GFP融合蛋白定位在烟草叶片细胞壁.毛白杨PtoPME34-1基因过表达显著提高植株的抗旱性.毛白杨PtoPME34-1和PtoPME34-2基因的双突变体植株中果胶甲酯化程度升高,且植物抗旱性也显著增加.这些研究结果证实PtoPME34-1在调控植物生长发育和抗旱胁迫中发挥重要作用.     

拟南芥中一个新的constans等位基因及特性

植物开花是由内外信号途径共同调控的,CONSTANS是长日照途径上控制开花的基因.在筛选拟南芥滞绿突变体的过程中筛选到一个晚花突变体,工作名称为fnc25.后来证实为一个新的constans突变体co-9.在长日照条件下该突变体植株高大,叶片呈深绿色,莲座叶数目增多,开花延迟,寿限显著延长;春化处理和外源施加赤霉素对其开花时间几乎没有响应,在短日照条件下开花时间几乎不变.测序发现co-9中CO基因编码区中有10个碱基的缺失导致了CO蛋白C末端92个氨基酸没有被合成,这其中包含一个CCT结构域.CO基因的功能缺失很可能是导致co-9晚花的原因.RT-PCR实验表明co-9中CO直接调控的基因FT的mRNA水平显著下调,而另一个调控的基因SOC1的mRNA水平和野生型相比没有改变.说明CO通过不同的结构域作用于下游目的基因,一个结构域的改变只影响下游一个目的基因的表达,导致co-9的晚花表型.     

金钗石斛VRN1-like基因的克隆及其表达分析

用20mg/L的噻重氮苯基脲（thidiazuron,TDZ）处理金钗石斛（Dendrobium nobile）成株叶片,观测其对开花的影响;以金钗石斛类原球茎为材料,通过同源克隆分离其VRN1-like同源基因,利用半定量RT-PCR分析细胞分裂素对该基因在腋芽和类原球茎中表达的影响. 结果表明,喷施TDZ可以代替低温处理诱导金钗石斛开花;通过同源克隆得到了金钗石斛VRN1-like基因DnVRNA的全长cDNA. 该cDNA编码的蛋白与高羊茅（Festuca arundinacea）和小麦（Triticum monococcum）中VRN1蛋白的氨基酸序列一致性分别为63%和62%. 半定量RT-PCR结果表明,DnVRNA在腋芽中的表达受TDZ的促进,而在类原球茎中,其表达也受到细胞分裂素和低温的诱导,暗示该基因可能参与细胞分裂素替代低温诱导金钗石斛成花的生物学过程.     

Isolation and ectopic expression of a bamboo MADS-box gene

A cDNA named DIMADS18 was isolated from the young spikelets of the sweet bamboo, Dendrocalamus latiflorus by RACE. DNA sequence analysis showed that DIMADS18 was composed of full ORF and 3UTR, but without 5UTR. The cDNA contained 1039 nucleotides and encoded a putative protein of 249 amino acid residues. The gene displayed the structure of a typical plant MADS box gene, which consisted of an MADS domain, K domain, a short I region, and the C-terminal region. Phylogenetic analysis of plant MADS box genes based on amino acid sequences revealed that DlMADS18 was grouped into the AGAMOUS-LIKE 6 (AGL6)-like subfamily. It was most likely homologous to the OsMADS6 of rice (Oryza sativa), with 88% sequence identity for the entire amino acid sequences. The DlMADS18 also showed relatively high amino acid sequence identity (59%) to AGL6 ofArabidopsis thaliana. To study the functions of DlMADS18, DlMADS18 cDNA clone driven by the CaMV 35S promoter was transformed into Arabidopsis plants. Transgenic plants of DlMADS18 exhibited the phenotypes of curled leaves, dwarfism, and early flowering with clustered terminal flowers. These results indicated that DlMADS18 may probably be involved in controlling the flowering time of D.latiflorus.     

一个水稻蛋白激酶的过表达分析及表达调控

对一个预测的具有光反应活性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK进行过表达研究,构建了STK过表达载体,并用农杆菌介导的方法进行遗传转化,获得T0代转基因植株.对转基因阳性植株进行表达分析的结果表明,转基因植株STK基因的表达量显著高于对照,说明目的基因得到了过表达.另外,利用获得的过表达转基因植株对STK调控水稻中光周期相关的开花基因Hd1和Hd3a的表达进行分析,结果表明,Hd1及Hd3a的表达在转基因植株中明显上调,表明该蛋白激酶的基因可能位于Hd1和Hd3a上游,对于Hd1和Hd3a的表达具有重要的调控作用.     

慢生型大豆根瘤菌染色体的16kb EcoRⅠ DNA片段的亚克隆测序分析

亚克隆测序分析发现，在Bradyrhizobium japonicum的GX201菌株染色体的16kb EcoR I DNA区段上含有一个与putA基因同源的基因的ORF 3054（Open Reading Frame)，该基因ORF长3054bp，在核苷酸水平上与已报道的putA基因有94％一致性，其推断性的编码产物在氨基酸水平上与putA编码产物脯氨酸脱氢酶（ProDH)有95％一致性，利用Tn5gusA5诱变的方法获得了该同源基因的标记置换突变体，该突变体在液体培养基（YMA）中的生长速率比野生菌株慢。     

菊花‘千手观音’LEAFY基因转录区基因组克隆和结构分析

LEAFY(LFY)基因在植物花发育过程中具有重要作用,不仅控制着花序分生组织向花分生组织的转变,而且控制着开花时间.通过基因组PCR扩增,获得了菊花‘千手观音’LFY同源基因序列.序列分析表明该基因包括2个内含子和3个外显子.其内含子1的2个序列长短不同,差异明显.2个内含子与甘菊的LFY同源基因DFL相比都表现出了丰富的变异性.其外显子推测的氨基酸序列与甘菊DFL的氨基酸序列相似性达99%.系统进化分析表明‘千手观音’的LFY同源基因与所有的菊属植物的LFY基因在树的同一枝上,且距双子叶植物的距离近于单子叶或裸子植物.Southern杂交表明,‘千手观音’基因组中LFY同源基因以两个拷贝形式存在.     

将GNA基因导入莴苣（L.sativa）及其表达的研究

将含ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的雪花莲凝集素基因置换Ｔｉ质粒载体ｐＢＩ１２１中的ＧＵＳ基因得到了ｐＢＩＧＮＡ质粒,将其导入农杆菌ＬＢＡ４４０４,得到ＬＢＡ４４０４菌株。