菲牛蛭繁殖性能的初步研究

为确定菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)体质量、年龄和应激刺激与菲牛蛭繁殖性能的关系,采用单因素方差分析在不同体质量、年龄、应激次数条件下,菲牛蛭的产卵和孵化情况.结果显示:不同体质量菲牛蛭亲本其繁殖能力有显著差异(P0.05),体质量为10～15g亲本产茧数最多,卵茧孵化率和孵化数最高;不同年龄菲牛蛭亲本,其繁殖能力差异显著(P0.01),实验中2～3龄亲本产茧数最多,卵茧孵化率和孵化数最高;适当的环境刺激对菲牛蛭的繁殖有促进作用,实验中1或2次操作刺激对菲牛蛭亲本产茧数、孵化率和孵化数均有明显的增加(P0.01).建议在菲牛蛭人工繁殖过程中,选取10～15g体质量、2～3年龄亲本进行繁殖,同时在繁殖过程中可适当对亲本进行1或2次刺激.     

几种水蛭抗凝血物质提取及活性分析

 研究3种提取方法对菲牛蛭不同处理品的抗凝作用,采用筛选的最佳提取方法分析了5种水蛭各处理品的抗凝血酶活性,并比较了3个不同地理分布野生菲牛蛭和2个不同饵料饲喂菲牛蛭各处理品的抗凝血酶活性。结果表明：丙酮浸提法在菲牛蛭各处理品中均具有最高的提取得率,所测抗凝血酶活性显著高于其他方法（P<0.05）;5种水蛭抗凝血酶活性测定结果显示非吸血蛭类的湿体匀浆液和干体无或微弱的抗凝活性,而吸血蛭类（日本医蛭和菲牛蛭）具有较高抗凝活性,且菲牛蛭的抗凝活性显著高于日本医蛭(P<0.01);不同地理分布野生菲牛蛭和不同饵料饲养菲牛蛭的湿体匀浆液、干体粉末和唾液腺分泌物抗凝活性均无显著差异（P>0.05）。研究表明菲牛蛭具有较强的体外抗凝血酶活性,且人工养殖对菲牛蛭的抗凝活性未产生不利影响。     

菲牛蛭的人工养殖方式试验

于2004年5月8日至2005年3月8日,采用垄沟、池塘和水泥池三种养殖方式进行菲牛蛭的人工养殖试验。结果表明:在菲牛蛭的生长期,其条均净增重和成活率分别是:垄沟组1.253g和91.7%,池塘组1.087g和79.3%,水泥池组0.919g和67.3%;垄沟组的净增重和成活率与池塘组呈显著性差异(P<0.05);与水泥池组比较呈极显著性差异(P<0.01);池塘组与水泥池组比较呈显著性差异(P<0.05)。在菲牛蛭的冬眠期,采用垄沟养殖的菲牛蛭,其越冬后的成活率为85.3%,显著高于池塘组的74.4%(P<0.05),而水泥池组的成活率为0;相对增重率为-12.6%,与池塘组的-13.5%差异不显著(P>0.05)。土壤可提高人工养殖菲牛蛭的成活率并能使其安全越冬,水泥池养殖不适合菲牛蛭的越冬。     

菲牛蛭冻干粉的重复给药毒性研究

通过观察啮齿类动物SD大鼠长期灌胃给予菲牛蛭冻干粉后产生的毒性反应及其严重程度,对菲牛蛭冻干粉进行重复给药毒性的研究,为其药用安全性评价提供科学依据.将SD大鼠随机分为溶媒对照组(无菌注射用水)、菲牛蛭冻干粉高、中、低剂量组(3.24、1.08和0.54 g/kg),给药质量浓度分别为205.5、67.5和33.75 mg/mL,给药体积以每周称量体重计算,每周连续灌胃给药6 d,给药周期6个月,末次给药后恢复8周.对其进行临床指标检测、脏器重量称量、血液学检查、血清生化检查、组织病理学检查,从而评估菲牛蛭冻干粉的毒理学安全性.结果在连续给予SD大鼠菲牛蛭冻干粉6个月后,各项指标均未发现与供试品相关的毒性变化.本试验条件下,SD大鼠给予高、中、低剂量菲牛蛭冻干粉未见明显毒性作用.     

PRELIMINARY STUDY ON REPRODUCTION TRAITS OF THE ItlRUDINARIA MANILLENSIS

为确定菲牛蛭（Hirudinaria manillensis）体质量、年龄和应激刺激与菲牛蛭繁殖性能的关系,采用单因素方差分析在不同体质量、年龄、应激次数条件下,菲牛蛭的产卵和孵化情况.结果显示：不同体质量菲牛蛭亲本其繁殖能力有显著差异（P〈0.05）,体质量为10～〈15g亲本产茧数最多,卵茧孵化率和孵化数最高;不同年龄菲牛蛭亲本,其繁殖能力差异显著（P〈0.01）,实验中2～3龄亲本产茧数最多,卵茧孵化率和孵化数最高;适当的环境刺激对菲牛蛭的繁殖有促进作用,实验中1或2次操作刺激对菲牛蛭亲本产茧数、孵化率和孵化数均有明显的增加（P〈0.01）.建议在菲牛蛭人工繁殖过程中,选取10～〈15g体质量、2～3年龄亲本进行繁殖,同时在繁殖过程中可适当对亲本进行1或2次刺激.     

菲牛蛭的研究进展

综述菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)的人工养殖技术、营养价值与化学成分、活性成分、药效学研究及临床应用、毒性与有害物质等方面的研究进展。菲牛蛭具有较高的营养价值,同时在临床上具有抗凝血、溶血栓、抗血小板聚集、降低血脂和改善血液循环等作用,并且未见明显毒副作用,是一种极具发展潜力的药用动物。     

相对密度和季节对菲牛蛭Hirudinaria manillensis繁殖习性的影响

采用单因素方差分析等方法分析人工养殖条件下相对密度和季节对菲牛蛭繁殖习性的影响。结果表明,秋冬季节,相对密度对亲蛭产茧率、产茧数和死亡率无显著影响(P0.05),而孵化率、孵化数、卵茧大小和湿质量在各组间差异显著(P0.05),其中高相对密度组(50尾/箱)显著低于其他组(P0.05)。春夏季节,相对密度对产茧率、孵化数和卵茧直径影响不显著(P0.05),而对产茧数、孵化率、死亡率及卵茧长和湿质量影响显著,其中低相对密度组(5尾/箱)的产茧数和孵化率显著高于其他组(P0.01),高相对密度组(50尾/箱)的死亡率显著高于其他组(P0.01),而高相对密度组(50尾/箱)的卵茧长和湿质量却显著低于其他组(P0.05)。结果显示,不同季节中亲蛭的繁殖指标均在低相对密度组(5尾/箱)获得最佳值,同时相同相对密度下季节对菲牛蛭繁殖具有显著影响,春夏季节的繁殖性能要明显优于秋冬季节,特别是春夏季节的卵茧孵化时间(44 d)明显较秋冬季节(100 d)短。研究获得了菲牛蛭繁殖的最佳相对密度,证实了在华南地区一年多季繁殖的可能性,可为其大规模人工繁殖提供参考。     

脑心通胶囊中水蛭的特异性DNA鉴别

建立正品水蛭(宽体金线蛭、日本医蛭)的DNA分子鉴别方法。基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列,分别设计了针对宽体金线蛭和日本医蛭的特异性引物,将其应用于水蛭药材正品、常见伪品菲牛蛭以及含水蛭的中成药脑心通胶囊的PCR技术检测。结果显示单独使用引物WF1R2或WF2R2均可以特异性扩增宽体金线蛭的DNA,产生大小为200 bp左右的条带;而引物HF1R2则可以特异性扩增日本医蛭,产生大小为142 bp的条带;这3对引物在伪品菲牛蛭中均无扩增条带。且用引物WF1R2和WF2R2均在脑心通胶囊中检测到宽体金线蛭,与胶囊所用投料药材一致。结果表明这3对引物可以分别对宽体金线蛭和日本医蛭进行特异性鉴别,且无需测序;而引物WF1R2和WF2R2可直接用于脑心通胶囊中所用水蛭正品的检控。该DNA分子鉴定方法简便、准确,特异性强且灵敏度高,可作为对传统基原鉴定方法的补充,进一步提高水蛭药材及含水蛭的中成药脑心通胶囊的质量控制水平。     

中国医蛭科动物地理研究

研究了中国医蛭科属级和种级动物地理分布、动物地理特征,及其与我国邻近地区的关系。结果表明:①中国医蛭科有6个属17种,医蛭属分布于古北界,东洋界和新热带界;牛蛭属、鼻蛭属只分布于东洋界;粘蛭属主要分布于东洋界,也分布古北界和新热带界;金线蛭属分布于东洋界和古北界;黄蛭属分布于古北界。②种的分布型,分布最广的软体粘蛭和光润金线蛭,由东洋界中印亚界南缘的印度半岛等直到古北界北部的俄罗斯。分布范围最小的是丽医蛭,分布于浙江丽水温州,南京牛蛭分布于南京,秀丽金线蛭分布于浙江、江苏,四条纹金线蛭只分布于海南岛海口。③种的分布型中,华中区南中国型物种数占总物种数64.7%,华中区南中国是医蛭科种分布中心,中南半岛、印度半岛分别占35.5%。种数最少的是西南区喜马拉雅——横断山型,只占11.76%。④种的分布型表明,南中国是医蛭科种的分布中心,它向北扩展到达俄罗斯,物种数较少,向南扩展到达东洋界南缘的中南半岛、印度半岛,物种数仍较多。     

医蛭形亚目常见物种系统发育基因组学研究

本研究基于GenBank中10个医蛭形亚目物种及2个近缘外类群的基因组或转录组数据，提取COI、18 S和蛋白编码核基因的直系同源序列（Orthologs），开展系统发育分析。比对后的COI、18 S和Orthologs序列长度分别为1533、1832、220095 bp。最大似然法和贝叶斯推断法分析显示，基于Orthologs序列构建的系统发育树在几乎所有节点上的支持率都达到100%，明显优于COI和18 S序列得到的结果。研究表明，医蛭科的欧洲医蛭、东方医蛭和侧纹医蛭组成一个单系群，医蛭科的日本医蛭与黄蛭科的宽体金线蛭和尖细金线蛭组成另一单系群，而黄蛭科的马蛭与上述6个物种形成姐妹群。医蛭科的两种牛蛭（菲牛蛭和棒纹牛蛭）组成一个单系群，此单系群与医蛭科的其他物种的遗传关系比马蛭更疏远；山蛭科的洞穴山蛭在10个医蛭形亚目种类中处于最基部位置。本研究阐明了医蛭形亚目常见物种的系统发育关系，为这些物种的资源开发利用和保护提供科学依据。     

室内饲养松墨天牛幼虫不同肠段细菌的群落结构及功能分析

【目的】了解室内饲养松墨天牛(Monochamus alternatus)幼虫前、中、后肠段细菌的群落结构,比较不同肠段之间菌群多样性和优势菌群的差异,为揭示肠道细菌在松墨天牛获取营养、克服寄主植物化学防御的机理提供参考。【方法】分别提取室内饲养的松墨天牛4龄幼虫前、中、后肠各3组样本(每组5个前肠、5个中肠、5个后肠)的肠道DNA。利用Illumina HiSeq技术对松墨天牛幼虫肠道细菌的16S rDNA V3-V4区序列进行文库构建和高通量测序。原始序列使用Trimmomatic软件和FLASH软件分别进行质控和拼接。利用USEARCH软件对序列进行操作分类单元(OTUs)聚类,统计OTUs数量并绘制Venn图。在门和属分类水平上统计各样本的群落组成及物种丰度情况。通过Alpha多样性和Beta多样性分析反映不同样本的菌群多样性和相似性。采用PICRUSt软件预测松墨天牛幼虫肠道细菌映射到KEGG数据库上的功能,探究不同肠段细菌群落发挥的潜在功能。【结果】共获得643 404条高质量序列,在97% 相似度下将其聚类为1 614个操作分类单元(OTUs),共注释到35门、63纲、137目、250科、554属和844种。前肠OTUs最少,后肠OTUs最多,每个肠段的OTUs组成上既有相似性,也存在差异性。变形菌门(Proteobacteria)为3个肠段中最优势门;葡糖杆菌属(Gluconobacter)为前肠中最优势属,沙雷氏菌属(Serratia)为中肠的最优势属,葡糖杆菌属和沙雷氏菌属同为后肠的最优势属。Alpha多样性显示中、后肠群落多样性更丰富;Beta多样性分析表明,3个肠段的细菌群落组成存在差异,但中肠与后肠的群落组成较相近。功能预测表明,整个肠道菌群中代谢功能丰度最高,其中以糖类代谢和氨基酸代谢为主,这些功能集中在中、后肠。【结论】本实验中菌群功能是基于PICRUSt软件预测的结果,松墨天牛幼虫室内种群的前、中、后肠的细菌群落结构及不同肠段细菌的潜在功能存在差异,是由于不同肠段内的理化性质差异及其在消化中发挥的不同功能所致。肠道细菌与松墨天牛幼虫形成一个共生功能体,菌群在协助幼虫代谢物质、获取营养以及克服寄主植物化学防御方面发挥着重要作用。     

济南地区蛭弧菌(Bdellovibrio)的初步研究

从济南地区的生活污水、湖水和土壤中分离到9株蛭弧菌。它们均为直或弯曲的杆状或弧状,大小为0.20～0.31μm×0.66～1.01μm。单根极生鞭毛。在其中2株蛭弧菌的细胞两端还发现有数根须状结构。蛭弧菌 No.1对氯仿敏感,它的增殖并不依赖于其寄主的增殖。它们的寄主范围较广,可以跨越属或科。温度对于蛭弧菌 No.1的增殖速度有显著影响。每个 E.coliK_(12)细胞约释放2个蛭弧菌 No.1细胞。     

甘南尕海草原毛虫肠道细菌群落结构分析

为探讨了甘南尕海自然保护区草原毛虫(Gynaephora aureate Ghou et Ying)肠道细菌群落结构组成,采集甘南尕海高寒草地3个不同地点的4龄草原毛虫幼虫,通过Illumina Hi Seq高通量测序平台对甘南尕海自然保护区草原毛虫肠道细菌群落结构组成进行分析,总共获得了206 098条序列。甘南尕海草原毛虫中肠的细菌由Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Tenericutes(软壁菌门)、Verrucomicrobia(疣微菌门)、Fusobacteria(梭杆菌门)、Acidobacteria(酸杆菌)、Deinococcus-Thermus(异常球菌-栖热菌门)和Planctomycetes(浮霉菌门)等10个门组成,优势菌群为Proteobacteria和Bacteroidetes。在属的水平上,Providencia(普罗威登斯菌)含量最丰富,其次是Brevundimonas(单胞菌属)、Bacteroides(拟杆菌属)和Methylotenera(甲基柔膜菌属)。阐明了甘南尕海草原毛虫肠道细菌群落的组成,为研究草原毛虫肠道微生物和草原毛虫对人畜的危害提供理论基础。     

四川西部黄牛的染色体核型与分类初探

采用外周血淋巴细胞培养,气干法制备染色体标本,对川西11个县的地方黄牛抽样进行染色体核型及带型研究并与黑白花奶牛、西门塔尔牛、秦川牛等普通牛(Bos tautus)的核型比较,结果表明:川西地方黄牛在遗传基础上和瘤牛(Bos indicus)基本一致而和普通牛存在显著差异:川西地方黄牛y染色体为近端着丝粒染色体(Acroccntric)普通牛y染色体为亚中着丝粒染色体(Submetacentric);核糖体基因的位置和数目三种牛之间也不相同;外部形态观察结果川西牛具有瘤牛的三种瘤峰、较发达的垂皮和体格特征,在生物学特性方面具有瘤牛的耐热、耐粗饲、抗湿、抗蜱等特点,根据上述细胞遗传学证据、结合形态学、生物学特性的研究认为:川西地方黄牛属Bos属瘤牛种(Bos indicus),对川西瘤牛的发生及演化作了初步探讨。     

嗜水气单胞菌感染暗纹东方鲀脾脏的蛋白质组学分析

为了解暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)受到病原菌感染后参与应答的主要蛋白的功能与调控作用,采用TMT标记、高效液相色谱(HPLC)分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术,分析了暗纹东方鲀感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)12 h后脾脏组织的蛋白表达水平,鉴定差异表达蛋白,并通过亚细胞定位、GO(Gene Oncology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)对差异表达蛋白进行进一步分析.本次实验共鉴定到306个差异表达蛋白,其中120个上调表达蛋白,186个下调表达蛋白;利用平行反应检测实验(PRM)对4个(1个上调,3个下调)与免疫相关的差异蛋白进行验证,其结果与蛋白质测序结果一致;亚细胞定位结果显示:差异表达蛋白主要定位在细胞质、细胞核和胞外;GO分析发现:差异表达蛋白参与的主要生物进程有代谢过程、细胞进程和单一生物进程,主要的分子功能有结合、催化活性和机构分析活性;KEGG通路分析结果显示:差异表达蛋白主要参与了核糖体、视黄醇代谢、卟啉和叶绿素代谢、ECM受体相互作用、吞噬体、叶酸生物合成、药物代谢、酪氨酸代谢等通路.研究结果为进一步探究病原菌感染暗纹东方鲀的致病机理提供了一定的理论基础.     

Illumina高通量测序分析百合内生真菌群落多样性

百合具有较高的药用食用价值,研究发现它的许多内生菌代谢产物有进一步开发利用的潜能,深入了解百合内生真菌群落结构与多样性,有助于发现新菌种以及具有特定功能的内生菌代谢产物。以ITS区的rDNA为靶标序列,采用Illumina MiSeq测序技术分别对百合叶片(bhy417)、百合茎秆(bhj417)和百合地下鳞茎(bhl417)三个样品的内生真菌群落结构组成和多样性进行测定分析。经过分析有以下结果:三个样品共得到用于后续样品分析的436394条有效序列和122205709个碱基;样品bhy417的内生真菌群落丰富度最大;三个样品之间的内生真菌群落多样性差异不显著、群落结构不同;球腔菌属Mycosphaerella、外囊菌属Taphrina、炭疽菌属Colletotrichum、散斑壳属Lophodermium、壳二孢属Ascochyta、Zymoseptoria属、Catenulostroma属、Phaeophleospora属、Endoconidiophora属、Hormonema属、乌氏霉属Uwebraunia、Capnobotrylla属、丛赤壳属Neonectria、长毛盘菌属Trichophaea等在样品中丰度较高。FUNGuild功能预测结果显示,百合内生真菌包括以下功能菌群:植物病原菌、动物病原菌、腐生菌、未定义腐生菌、内生菌、木材腐生菌、地衣寄生菌等。研究结果表明百合有丰富的内生真菌定殖,其中的植物病原菌以及一些目前还未鉴定出来的菌将可能对百合生防菌以及具特定功能代谢产物的研发提供帮助。     

海洋琼胶降解菌FG15基因组从头测序分析

为充分了解琼胶降解菌FG15的基因功能和代谢途径,本研究使用SOAP de novo 2.04对Illumina Hiseq2000平台测序产生的基因片段进行了拼接和组装,同时利用Glimmer 3.02来预测基因的开放性阅读框,并采用蛋白质直系同源基因簇(COG)、基因本体数据库(GO)以及京都基因和基因组百科全书(KEGG)的数据来预测其基因功能,获得了代谢途径.结果表明:FG15的基因组大小为5.10 Mb,G+C含量为44.58%,共有38条Scaffolds,4 922个开放性阅读框,82个tRNA,2个rRNA;通过COG分析可将菌株FG15注释到22种COG功能类型,主要包括细胞代谢、细胞信号转导等;利用GO注释可将FG15注释到3大类39个GO功能亚类上;KEGG分析能将其定位到154个代谢通路中,包括物质代谢、次生代谢产物的生物合成等.次生代谢产物的合成代谢途径精确显示,FG15能合成青霉素和头孢菌素,且其与抗生素抗性实验的结果一致.研究结果为FG15功能基因组学的研究和相关次级代谢产物的生物合成途径以及异源表达的研究提供了理论基础.     

金发藓属化学成分及抗肿瘤作用研究进展

从金发藓的化学成分、抗肿瘤活性和抑癌机制等方面对国内外金发藓属植物研究的现状进行了综述.已有研究表明,在金发藓属(Polytrichumspp.)植物中分离得到苯并萘并呫吨酮类化合物及其衍生物、苯乙烯醛基并联苄化合物和苯乙烯基并二氢黄酮类化合物等具有新颖结构骨架的化合物,药理活性分析显示这些新化合物对体外培养的多种肿瘤细胞(如:A-549人肺癌细胞、HepG2人肝癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞等)均具有一定的细胞毒性,并能显著抑制白血病细胞(6T-CEM人T细胞白血病细胞和小鼠P388、L1210白血病细胞)的增殖.其作用机制可能与线粒体功能损伤、活性氧失衡、细胞周期阻滞、破坏细胞膜及诱导凋亡相关.未来可从化学结构与抗肿瘤活性的构效关系、在体抑癌效果、药物代谢、抗肿瘤机制等方面展开深入研究.     

深圳湾和大鹏湾微生物群落结构及其功能预测比较分析

多样性丰富的微生物对海洋生态系统的稳定起着主导作用,采用Illumina Miseq测序技术,针对深圳大鹏湾和深圳湾,综合比较分析两者的表层海水微生物多样性,预测其微生物生态功能差异。结果表明大鹏湾水体微生物群落的Shannon、Simpson、Chao1和ACE多样性指数及菌群OTUs高于深圳湾的水体。大鹏湾和深圳湾的微生物群落在门水平分别有24和10个菌门,两者主导菌门都为蓝藻细菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、浮霉菌门,这六个分别占其总微生物群落的99.3%和99.9%。然而各菌门在2个水体中的相对丰度不同,且在纲、目、科、属等分类水平的菌群结果也表明群落组成差异显著,在属水平发现隶属于蓝藻菌门的原绿球藻(60%)主导了深圳湾的表层水体,而大鹏湾的主导蓝藻菌属为未被分离出纯菌株的菌群。代谢功能预测初步揭示了大鹏湾和深圳湾水体微生物的代谢功能有所差异,主要体现在生物降解功能、脂质代谢、酶系统和碳水化合物代谢等方面。该研究为认识海洋微生物多样性与海域生态系统的保护修复提供基础数据和理论支撑。     

对海南地区石斑鱼养殖中鱼蛭病的初步研究

近年来,在海南地区养殖的石斑鱼鱼体上寄生了一种鱼蛭,为了了解该蛭的种类、宿主和寄生偏好,对该蛭进行了形态学观察,并基于NJ法构建了COI、NDI和18s rDNA基因的系统发生树,调查和总结了该蛭的宿主和寄生偏好.基于COI、NDI和18s rDNA基因序列的系统发生树和比对分析显示,该蛭与在Borneo采集的菲律宾蛭的亲缘关系最近,为同一个种;此外,在海南地区发现了菲律宾蛭的9种海水鱼类宿主,这些宿主为豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)、棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)、点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)、鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)、珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus lanceolatus♂×Epinephelus fuscoguttatus♀)、驼背鲈(Cromileptes altivelis)、波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)、六斑刺鲀(Diodon holocanthus)等,而且发现菲律宾蛭最喜欢寄生在豹纹鳃棘鲈上,其对5种石斑鱼的寄生偏好依次为:豹纹鳃棘鲈点带石斑鱼≥棕点石斑鱼珍珠龙胆石斑鱼龙胆石斑鱼.笔者推测:寄生在海南地区养殖石斑鱼体上的菲律宾蛭是通过石斑鱼贸易而进入海南的一个外来种,该蛭对海南地区其他海水鱼类的养殖不会直接造成损害,但该蛭的繁殖速度快,易引起石斑鱼烂身、消瘦、营养不良、严重减产等,更可能成为血液细菌、病毒、寄生虫等微生物传播的媒介,从而存在引发海水养殖鱼类大量发病的可能.