大鼠血管内皮细胞siRNA转染条件的优化

目的:旨在优化siRNA转染大鼠血管内皮细胞的转染条件.方法:将0.75μL和1.5μL的脂质体LipofectamineTM3000分别与20、40、60、80nmol带荧光标记的FAMsiRNA组合,转染6、12、18、24h后,用荧光显微镜计数阳性细胞率、MTT法检测各浓度条件下内皮细胞的存活率,筛选最优转染条件.结果:(1)转染12h后,用荧光显微镜检测20、40、60、80nmol各组,均可观察到绿色荧光(2)siRNA浓度为60nmol/L,脂质体为1.5μL的组合转染效率最高,继续增加siRNA的浓度,转染效率提高不明显.(3)转染时间超过24h,各组细胞荧光减弱,细胞死亡率显著增加.结论:结果表明,以1.5μL LipofectamineTM3000与60nmol/L的siRNA浓度组成转染混合物转染12h可以实现对大鼠血管内皮细胞高效转染并保持较高的细胞活性.     

磷酸钙转染方法的优化

通过比较293T细胞的接种密度、质粒DNA的量以及CO2浓度对磷酸钙转染方法的影响,确定最佳的转染条件.以各单因素试验的最适条件为依据,设计三因素三水平的正交试验.结果表明,磷酸钙介导质粒DNA转染,当293T细胞的接种密度为5×105/mL、质粒DNA的量为30μg、细胞培养环境CO2浓度为3%时,转染效果最佳.     

山羊精子电穿孔转染外源DNA影响因素及最适条件的研究

本文以山羊精子为材料用电穿孔导入法转染外源基因,为生产转基因山羊奠定基础。用血细胞计数器在显微镜下记数死亡精子数检测精子活力,并用原位杂交实验检测电击精子消化前、后阳性率,以探讨山羊精子电穿孔转染外源DNA的方法及影响因素,摸索并优化电穿孔转染程序和条件。结果显示:电穿孔导入法可用于山羊精子介导转染外源DNA;电场强度、电击时间和电击次数同时影响精子活力,其中电击时间显著影响外源DNA的内化转运(P<0.05),山羊精子最适电穿孔条件为400V、200μs、电击1次,该条件下电击后精子活力和消化前、后阳性率分别为0.45和27.6%、22.5%;最适电穿孔条件下电击洗涤精子比未洗涤精子的消化后阳性率提高14%(P<0.01),将洗涤精子与外源DNA共孵育后再电击比不孵育处理组的消化后阳性率提高5.8%(P>0.05);电穿孔处理消化后阳性率在个体间无显著差异,且电击转染的精子被内化转运到精细胞内的外源DNA分布不规则。结果表明,山羊精子电穿孔转染外源DNA的最适转染条件为对精子充分离心洗涤并与外源DNA共孵育后,在400V/200μs条件下电击1次。     

山羊精子电穿孔转染外源DNA影响因素及最适条件的研究

本文以山羊精子为材料用电穿孔导入法转染外源基因,为生产转基因山羊奠定基础.用血细胞计数器在显微镜下记数死亡精子数检测精子活力,并用原位杂交实验检测电击精子消化前、后阳性率.以探讨山羊精子电穿孔转染外源DNA的方法及影响因素,摸索并优化电穿孔转染程序和条件.结果显示:电穿孔导入法可用于山羊精子介导转染外源DNA;电场强度、电击时间和电击次数同时影响精子活力,其中电击时间显著影响外源DNA的内化转运(P＜0.05),山羊精子最适电穿孔条件为400V、200μs、电击1次,该条件下电击后精子活力和消化前、后阳性率分别为0.45和27.6%、22.5%;最适电穿孔条件下电击洗涤精子比未洗涤精子的消化后阳性率提高14%(P＜0.01),将洗涤精子与外源DNA共孵育后再电击比不孵育处理组的消化后阳性率提高5.8%(P＞0.05);电穿孔处理消化后阳性率在个体间无显著差异,且电击转染的精子被内化转运到精细胞内的外源DNA分布不规则.结果表明,山羊精子电穿孔转染外源DNA的最适转染条件为对精子充分离心洗涤并与外源DNA共孵育后.在400V/200μs条件下电击1次.     

侵染钝齿棒状杆菌的噬菌体T-1转染研究

作者就本实验室分离到的一株对钝齿棒状杆菌B_9具有转导作用的噬菌体T_1,研究了噬菌体DNA的转染条件、钝齿棒状杆菌球状体的制备条件与转染频率的关系.证明以1％甘酸氨和0.8μ/ml青霉素培养,再经1mg/ml溶菌酶破壁处理10-16h效果较好;比较了各种二价阳离子和PEG对转染频率的效应,30mM CaCl,和16％PEG结合处理可提高转染频率,单独加Ba~( )或PEG,对转染无作用,二者结合处理有作用;加小牛血清白蛋白及37℃加温处理5min可提高转染频率,最适条件下,高达9.5×10~(-3)p.f.u./cell(2.8×10~6p.f.u./μg DNA)。噬菌体T-1对钝齿棒状杆菌是专一的,但以它的DNA对其它一些棒状杆菌也能转染,表明噬菌体T-1的受点与细胞壁有关.     

MDV中meq基因对CEF细胞chTERT,chTR表达影响的研究

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR方法检测了MDV中meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT)、端粒酶RNA亚基(chTR)表达水平的影响,并用TRAP法测定了端粒酶活性,用流式细胞仪检测了细胞周期的变化.实验结果表明,转染48 h后chTERT表达水平为转染后72 h的16倍,chTR表达水平在转染前后基本不变;转染48 h后CEF细胞的相对端粒酶活性是转染72 h后的12倍;在转染后72 h S期细胞的百分比较未转染细胞显著增加.     

流式细胞术优化MDCK细胞基因转染效率的研究

为探究脂质体介导的MDCK细胞基因转染效率,并获得最佳的优化方案,本研究选取不同配比的质粒和脂质体浓度,将p-EGFP-C1质粒转入MDCK细胞。转染后36h,利用台盼蓝染色法检测细胞活率,流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率,获得优化的转染条件。结果发现,转染后MDCK细胞,实验组细胞活力与阴性对照组差异不显著(P>0.05)。当质粒(μg)∶脂质体(μL)浓度配比为0.5∶1.0、0.5∶1.25、0.5∶1.5时,转染率达到了较高水平,分别为(23.4±3.4)%、(24.5±4.5)%、(25.2±3.7)%,从经济因素考虑,脂质体介导的MDCK细胞基因转染质粒(μg)与脂质体(μL)的最佳配比浓度为0.5∶1.0。这为MDCK细胞用于基因转染提供了一定的理论基础。     

阳离子脂质体介导基因转染的实验教学改革

通过优化细胞转染条件,探讨脂质体与DNA的复合比例、复合时间以及转染时间对脂质体介导的基因转染效率的影响。实验采用凝胶阻滞电泳分析脂质体完全包裹DNA时二者的复合比,通过转染绿色荧光蛋白报告基因(pEGFP)研究脂质体/pEGFP的复合比例、复合时间对细胞转染效率的影响。激光扫描共聚焦成像进一步分析转染时间对细胞摄取DNA量的影响。实验结果表明,脂质体和DNA的复合比例为1.25时,细胞的转染效率最高。转染4 h后,大量DNA被细胞摄取,此时可以更换新鲜的培养基。     

AFP基因shRNA表达质粒稳定转染肝癌细胞克隆的构建

甲胎蛋白(AFP)是一种重要的胚胎期及肝癌相关蛋白,为了深入研究其在肝癌细胞增殖中的作用,构建了针对AFP基因的shRNA表达质粒,拟建立可稳定转染的肝癌细胞克隆;利用生物信息学方法设计shRNA,经酶切连接和抗生素筛选构建表达质粒;通过酶切、琼脂糖凝胶电泳及测序对质粒加以验证;优化转染条件后采用脂染法转染肝癌SMM C-7721细胞,利用Purom yc in筛选稳定转染的细胞克隆.成功获得高特异的shRNA设计结果,构建了针对人类AFP基因的shRNA表达质粒,并获得该质粒稳定转染的细胞克隆.     

磷酸钙法转染哺乳动物非贴壁细胞

对一种哺乳动物的非贴壁细胞———ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５进行了Ｇ４１８敏感浓度以及甘油耐受性的测定；并通过磷酸钙法用含ＨＣＶＣ、Ｅ１、Ｅ２基因以及筛选标记基因———ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＥ２进行了转染。经Ｇ４１８筛选，获得了Ｇ４１８抗性细胞：Ｐ８１５－ＣＥ２。目前，Ｐ８１５－ＣＥ２细胞在Ｇ４１８选择压力下，已连续筛选８０余天，成功传代１２次，提示转染获得成功。实验表明：被转染细胞是否贴壁，不是决定磷酸钙法转染成功与否的决定因素；为了制备符合转染要求的合适的磷酸钙———ＤＮＡ混合物，所需各试剂的用量应该被优化。